紫蘇FAD3-FAD7基因種子特異性表達(dá)載體的構(gòu)建及遺傳轉(zhuǎn)化研究.pdf

1、α-亞麻酸（ALA）是一種人體必需的ω-3系列多不飽和脂肪酸，在體內(nèi)可以代謝為DHA和EPA，具有增強(qiáng)智力、保護(hù)視力、預(yù)防心腦血管疾病、調(diào)節(jié)血壓、血脂等功能。目前，ALA主要來(lái)源于深海魚(yú)油，但我國(guó)食用油以植物油為主，如菜籽油、豆油、葵花油等，但它們ALA含量都較低，因此，在正常飲食情況下，我國(guó)國(guó)民每日攝入的ALA往往達(dá)不到人體所需。為改善國(guó)人ALA攝入不足的現(xiàn)狀，開(kāi)發(fā)富含ALA的植物資源具有重要的意義。菜籽油是我國(guó)主要的食用油之一，如果

2、能提高油菜籽中ALA含量，則可以提高菜籽油的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，并可以成為一個(gè)高含量的植物ALA來(lái)源。
　　植物ALA主要存在于植物種子油脂中，由ω-3脂肪酸脫氫酶（FAD3、FAD7、FAD8）催化亞油酸轉(zhuǎn)化而來(lái)，ω-3 FAD基因是ALA合成途徑中的一個(gè)關(guān)鍵限速酶基因，通過(guò)調(diào)節(jié)該基因的過(guò)量表達(dá)，可以提高植物中ALA含量。紫蘇是目前發(fā)現(xiàn)的ALA含量最高的油料作物，本研究利用PCR技術(shù)，克隆了紫蘇高表達(dá)的FAD3、FAD7基因，并構(gòu)建種子特

3、異性表達(dá)載體pC2301M1NPB-EFAD3，pC2301M1NPB-EFAD7，通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)法進(jìn)行了美國(guó)煙草和中雙11號(hào)油菜的遺傳轉(zhuǎn)化研究。主要取得了如下研究結(jié)果：
　　1、克隆獲得的紫蘇FAD3基因片段全長(zhǎng)1240bp，F(xiàn)AD7基因片段全長(zhǎng)長(zhǎng)1370bp，通過(guò)NCBI在線比對(duì)，與已發(fā)表的紫蘇FAD3/FAD7基因同源性均高達(dá)99％以上，可以用來(lái)構(gòu)建表達(dá)載體。
　　2、成功構(gòu)建了pC2301M1NPB-EFAD3、pC

4、2301M1NPB-EFAD7種子特異性表達(dá)載體；該表達(dá)載體具有種子特異性啟動(dòng)子nap A啟動(dòng)子和nptⅡ篩選標(biāo)記。
　　3、以煙草葉片為外植體，通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)法對(duì)煙草進(jìn)行了遺傳轉(zhuǎn)化研究。通過(guò)Kan抗性初步篩選出批量抗性植株，對(duì)抗性植株進(jìn)行分子鑒定，結(jié)果表明：有24株能擴(kuò)增出NAP+FAD3基因片段，26株能擴(kuò)增出NAP+FAD7基因片段，說(shuō)明紫蘇FAD3、FAD7基因已成功地整合到煙草的染色體中。qRT-PCR分析結(jié)果表明，紫蘇

5、FAD3基因在轉(zhuǎn)基因煙草種子中的表達(dá)不穩(wěn)定，有升高也有降低。種子脂肪酸成分分析顯示，有一株FAD3轉(zhuǎn)基因煙草的ALA含量升高，ALA含量約為FAD3轉(zhuǎn)基因陰性煙草的2.4倍，同時(shí)亞油酸含量升高，油酸含量降低；但其FAD3基因表達(dá)量并沒(méi)有升高而是降低。其他FAD3轉(zhuǎn)基因煙草的ALA含量與轉(zhuǎn)基因陰性煙草幾乎沒(méi)有變化，但它們基因表達(dá)量卻明顯升高。檢測(cè)的FAD7轉(zhuǎn)基因煙草陽(yáng)性植株與陰性植株的ALA含量沒(méi)有差異。
　　4、以4天齡的油菜子葉

6、為外植體，通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)法對(duì)油菜進(jìn)行了遺傳轉(zhuǎn)化研究。通過(guò)Kan抗性篩選和分子鑒定，獲得1株含有紫蘇FAD3基因的轉(zhuǎn)基因油菜，編號(hào)為8，說(shuō)明紫蘇FAD3基因已成功整合到油菜的染色體中。RT-PCR分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，紫蘇FAD3基因只在8號(hào)油菜的種子中表達(dá)，而在葉片中不表達(dá)，說(shuō)明構(gòu)建的種子特異性表達(dá)載體成功地將紫蘇的FAD3基因表達(dá)限制在了種子內(nèi)。qRT-PCR分析顯示，紫蘇FAD3基因在8號(hào)轉(zhuǎn)基因油菜中表達(dá)量明顯高于5號(hào)轉(zhuǎn)基因陰性油菜，說(shuō)明紫