花生種子特異表達載體構建與農(nóng)桿菌介導基因轉化技術體系的優(yōu)化.pdf

1、花生是世界范圍內(nèi)廣泛栽培的油料與經(jīng)濟作物,是全球四大油料作物之一,也是我國單產(chǎn)、總產(chǎn)和出口創(chuàng)匯額最高的油料作物。利用轉基因技術改良花生籽仁品質是花生分子育種研究的重要領域。本研究采用同源克隆技術從花生栽培品種豐花3號基因組中分離獲得了兩個種子特異表達啟動子,并構建成了種子特異表達載體；研究了基因型、芽叢誘導培養(yǎng)基和芽叢成苗培養(yǎng)基三個因素對花生胚小葉再生效率的影響,獲得了三因素最優(yōu)組合的花生胚小葉離體再生體系；并對21個基因型花生進行了基

2、因轉化效率的比較研究,獲得了轉基因植株,PCR檢測證明目的基因已整合到花生基因組中。為花生品質改良的分子育種研究奠定了基礎。其主要結果如下： 1. 花生油體蛋白Oleosin基因啟動子的克隆及其種子特異表達載體的構建根據(jù)GeneBank上發(fā)表的花生Oleosin17.8基因的序列(EF695400)設計引物,用豐花3號基因組DNA為模板進行PCR擴增花生Oleosin啟動子,瓊脂糖凝膠電泳回收PCR擴增的目的片段,并與克隆載體p

3、GM-Teasy連接,獲得重組質粒pT-OL1584,序列分析表明,獲得的啟動子序列長1584bp,與GenBank發(fā)表的Oleosin17.8啟動子同源性為99.37％,除含有TATA、CAAT基本轉錄元件外,還有2個富含AT序列、2個RY重復序列元件、1個ACCCCA元件,2個TACACAT盒、5個CATG盒、5個E-Box、6個GATA-Box及14個DOF蛋白的AAAG基序等種子特異型啟動子所具有的順式作用元件。OL1584的G

4、eneBank登錄序列號為EU518466。重組子pT-OL1584用HindⅢ、BamH Ⅰ雙酶切,并回收目的OL1584基因片斷和切除35S啟動子的pBI121載體DNA,經(jīng)連接構建成種子特異表達載體pB-OL1584。并且在OL1584內(nèi)部設計2個上游引物以重組質粒pT-OL1584為模板,進行PCR擴增,獲得含Oleosin啟動子5’端缺失片段的重組子pT-OL755和pT-OL375。 2.花生致敏蛋白基因Ara h1

5、啟動子的克隆及其種子特異表達載體的構建參考王靜(2005)和Olga M(2003)報道的花生Ara h1基因的序列設計引物,用豐花3號基因組DNA為模板進行PCR擴增花生Ara h1啟動子,1.2％瓊脂糖凝膠電泳回收PCR擴增的目的片段,并與克隆載體pGM-T easy連接,獲得重組質粒pT-Ah1968,序列分析表明,Ah1968(GeneBank登錄號為EU526898)啟動子序列長1968bp,與王靜發(fā)表的序列同源性為99.14

6、％,與Olga M發(fā)表的序列同源性為98.27％.Ah1968除含有基本轉錄元件TATA、CAAT外,還含有3個AT-Rich、2個RY元件、3個CATG、1個ACCCCA、2個E-Box、2個TACACAT類似序列、2個TAACACA、10個GATA-Box和13個AAAG(DOF蛋白結合基序)等種子特異型啟動子所具有的順式作用元件。重組子pT-Ah1968和質粒pBI121分別用HindⅢ、BamH I雙酶切,并回收目的基因片斷(約

7、1716bp)和切除35S啟動子的pBI121載體DNA,經(jīng)連接構建成種子特異表達載體pB-Ah1716。在Ah1968內(nèi)部設計3個上游引物以重組質粒pT-Ah1968為模板,進行PER擴增,獲得了Ara h1啟動子5’端缺失片段的重組子pT-Ah1300、pT-Ah1000和pT-Ah500。 3. 花生胚小葉離體再生技術體系的優(yōu)化(1) 不同品種適宜芽叢誘導培養(yǎng)基的篩選小花生品種豐花2號適宜的芽叢誘導培養(yǎng)基為MSB+3.0m

8、g/L BA+0.7mg/L NAA,芽叢誘導率為81.49％,再生率為94.39％；大花生品種豐花3號適宜的芽叢誘導培養(yǎng)基為MSB+4.5mg/L BA+0.2mg/L NAA,芽叢誘導率為72.33％,再生率為10.70％。 (2) 不同品種適宜芽叢成苗培養(yǎng)基的篩選豐花2號適宜的芽叢成苗培養(yǎng)基為MSB+2.5mg/L BA,芽叢出苗率、再生率分別為：172.00％和122.10％；豐花3號適宜的芽叢成苗培養(yǎng)基為MSB+5.0mg/L

9、 KIN,芽叢出苗率、再生率分別為：33.33％、4.03％。 不同基因型之間的成苗芽叢百分率、芽叢出苗率和植株再生率差異顯著,基因型不同是造成花生再生率差異的主要因素。以胚小葉為外植體獲取較高植株再生率的三因素最佳組合為：花生品種豐花2號、芽叢誘導培養(yǎng)基為MSB+3.0mg/L BA+0.7mg/L NAA,芽叢成苗培養(yǎng)基為MSB+2.5mg/L BA?？勺鳛榛ㄉ蜣D化良好的受體系統(tǒng)。 4. 不同基因型花生基因轉化效

10、率的比較以花生胚小葉為外植體,用攜帶有γ-維生素E甲基轉移酶基因(γ-tmt)和篩選標記基因bar的植物表達載體(質粒為pGBVE,根癌農(nóng)桿菌為GV3101),對花生21個基因型進行了基因轉化。結果表明：農(nóng)桿菌侵染后再生率較高的10個基因型為：豐花2號、02P181、豐花3號、不結瘤系、豐花1號、白沙1016、豐花6號、05D651、?；?號、蓬萊-窩猴；基因轉化率較高的5個基因型為：豐花2號、豐花1號、豐花3號、白沙1016、02P1