棉花鹽脅迫應答基因GhSR13的克隆和功能分析.pdf

1、隨著土地環(huán)境不斷惡化，鹽堿地面積不斷擴大，如何有效利用這些鹽堿地，成為擺在我們面前的現(xiàn)實問題。棉花具有很高的耐鹽性和耐旱性，可是在實際的生產(chǎn)過程中，可利用的耐鹽耐旱品種并不多見，這就需要通過基因工程手段或者分子生物學手段，尋找出一些耐鹽基因，然后運用基因工程技術，培育出優(yōu)良的棉花品種。
　　前期利用基因芯片測序技術，得到一條EST序列信息，通過NCBI數(shù)據(jù)庫比對分析，陸地棉數(shù)據(jù)庫公布的基因信息，成功克隆了該基因的CDS全長序列，并

2、命名為GhSR13。該基因CDS全長1476 bp，編碼492個氨基酸。隨后進行有關GhSR13序列生物信息學的分析。首先，對GhSR13的蛋白家族進行分析發(fā)現(xiàn)，該基因?qū)儆贒DE_Tnp_1_6家族。隨后結合NCBI數(shù)據(jù)庫，以及最近公布的二倍體和四倍體棉花4數(shù)據(jù)庫，做了棉花同源種屬的同源性分析和不同種屬的同源性分析，并對該EST序列的開放閱讀框以及保守結構域進行了預測分析。通過同源性比對，在番茄以及擬南芥中都發(fā)現(xiàn)了與GhSR13同源的基

3、因，同源性達到了50％以上，在番茄中該同源基因已經(jīng)被證明參與鹽脅迫反應途徑，而在擬南芥中，該同源基因也被證明響應鹽脅迫途徑。在得到了該基因的CDS序列后，開展了以下實驗。
　　首先對該基因是否響應鹽脅迫作了定量分析，在用200 mM NaCl處理后，在0 h，1 h，4 h，6 h，12 h，24 h，分別提取棉花的真葉和根的RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA后進行定量分析。結果表明，在根中，GhSR13的表達量發(fā)生了明顯的變化，推測測其可能

4、參與了鹽脅迫反應途徑。
　　隨后，構建了GhSR13-GFP和GhSR13-GUS等一系列的載體，進一步研究該基因是否響應鹽脅迫。GFP熒光亞細胞定位結果表明，GhSR13蛋白定位于細胞核。GUS染色結果表明，該基因主要在根成熟區(qū)表達。通過構建表達有GhSR13-PYES2的酵母菌株并進行鹽處理發(fā)現(xiàn)，在200 mM NaCl，10 mM LiCl處理條件下，含有目的基因的酵母菌落生長狀況均不如空白對照，進一步表明該基因是參與了鹽脅

5、迫反應途徑。在隨后的VIGS實驗中發(fā)現(xiàn)，600 mM NaCl處理后的棉花葉片發(fā)生明顯的萎蔫，而且被干涉掉的基因棉花植株萎蔫程度要比對照高，表明在基因干涉掉后，加劇植物對鹽脅迫途徑的調(diào)控反應，造成植株對鹽的耐受性降低。通過將棉花基因轉(zhuǎn)入擬南芥材料獲得轉(zhuǎn)基因植株，選取了3個株系（OE-2，OE-3，OE-4）進行鹽處理的表型實驗，結果表明，（OE-2，OE-3， OE-4）這三個轉(zhuǎn)基因種子在萌發(fā)上對鹽的敏感性明顯要比野生型高，根伸長也表現(xiàn)