棉花鹽脅迫應(yīng)答基因GhSR13的克隆和功能分析.pdf

1、隨著土地環(huán)境不斷惡化，鹽堿地面積不斷擴(kuò)大，如何有效利用這些鹽堿地，成為擺在我們面前的現(xiàn)實(shí)問題。棉花具有很高的耐鹽性和耐旱性，可是在實(shí)際的生產(chǎn)過程中，可利用的耐鹽耐旱品種并不多見，這就需要通過基因工程手段或者分子生物學(xué)手段，尋找出一些耐鹽基因，然后運(yùn)用基因工程技術(shù)，培育出優(yōu)良的棉花品種。
　　前期利用基因芯片測(cè)序技術(shù)，得到一條EST序列信息，通過NCBI數(shù)據(jù)庫比對(duì)分析，陸地棉數(shù)據(jù)庫公布的基因信息，成功克隆了該基因的CDS全長(zhǎng)序列，并

2、命名為GhSR13。該基因CDS全長(zhǎng)1476 bp，編碼492個(gè)氨基酸。隨后進(jìn)行有關(guān)GhSR13序列生物信息學(xué)的分析。首先，對(duì)GhSR13的蛋白家族進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，該基因?qū)儆贒DE_Tnp_1_6家族。隨后結(jié)合NCBI數(shù)據(jù)庫，以及最近公布的二倍體和四倍體棉花4數(shù)據(jù)庫，做了棉花同源種屬的同源性分析和不同種屬的同源性分析，并對(duì)該EST序列的開放閱讀框以及保守結(jié)構(gòu)域進(jìn)行了預(yù)測(cè)分析。通過同源性比對(duì)，在番茄以及擬南芥中都發(fā)現(xiàn)了與GhSR13同源的基

3、因，同源性達(dá)到了50％以上，在番茄中該同源基因已經(jīng)被證明參與鹽脅迫反應(yīng)途徑，而在擬南芥中，該同源基因也被證明響應(yīng)鹽脅迫途徑。在得到了該基因的CDS序列后，開展了以下實(shí)驗(yàn)。
　　首先對(duì)該基因是否響應(yīng)鹽脅迫作了定量分析，在用200 mM NaCl處理后，在0 h，1 h，4 h，6 h，12 h，24 h，分別提取棉花的真葉和根的RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA后進(jìn)行定量分析。結(jié)果表明，在根中，GhSR13的表達(dá)量發(fā)生了明顯的變化，推測(cè)測(cè)其可能

4、參與了鹽脅迫反應(yīng)途徑。
　　隨后，構(gòu)建了GhSR13-GFP和GhSR13-GUS等一系列的載體，進(jìn)一步研究該基因是否響應(yīng)鹽脅迫。GFP熒光亞細(xì)胞定位結(jié)果表明，GhSR13蛋白定位于細(xì)胞核。GUS染色結(jié)果表明，該基因主要在根成熟區(qū)表達(dá)。通過構(gòu)建表達(dá)有GhSR13-PYES2的酵母菌株并進(jìn)行鹽處理發(fā)現(xiàn)，在200 mM NaCl，10 mM LiCl處理?xiàng)l件下，含有目的基因的酵母菌落生長(zhǎng)狀況均不如空白對(duì)照，進(jìn)一步表明該基因是參與了鹽脅

5、迫反應(yīng)途徑。在隨后的VIGS實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，600 mM NaCl處理后的棉花葉片發(fā)生明顯的萎蔫，而且被干涉掉的基因棉花植株萎蔫程度要比對(duì)照高，表明在基因干涉掉后，加劇植物對(duì)鹽脅迫途徑的調(diào)控反應(yīng)，造成植株對(duì)鹽的耐受性降低。通過將棉花基因轉(zhuǎn)入擬南芥材料獲得轉(zhuǎn)基因植株，選取了3個(gè)株系（OE-2，OE-3，OE-4）進(jìn)行鹽處理的表型實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明，（OE-2，OE-3， OE-4）這三個(gè)轉(zhuǎn)基因種子在萌發(fā)上對(duì)鹽的敏感性明顯要比野生型高，根伸長(zhǎng)也表現(xiàn)