玉米CMS-S核恢復(fù)基因和玉米對淹水脅迫響應(yīng)基因的功能分析.pdf

1、雜種優(yōu)勢的利用是提高作物單位面積產(chǎn)量的有效途徑。玉米(ZeamaysL.)是世界上最早利用雜種優(yōu)勢的作物之一。利用不育系進行雜交制種可以免去人工去雄，降低了勞動成本、提高種子純度，在雜種優(yōu)勢的利用中具有明顯的優(yōu)越性。為了更好地發(fā)揮玉米不育系在雜種優(yōu)勢利用中的作用，在理論上闡明細胞質(zhì)雄性不育(CMS)和育性恢復(fù)機理具有重要的理論意義，同時在核質(zhì)互作分子機理的研究領(lǐng)域中，CMS已成為重要的模式性狀。玉米CMS-S系的育性由線粒體上嵌合基因o

2、rf355/orf77和核基因(Rf3/rf3)共同決定。雖然orf355/orf77已被克隆，并對其影響細胞質(zhì)和核基因的表達進行許多研究，但核育性基因Rf3/rf3的克隆，表達產(chǎn)物的鑒定、與線粒體基因和其他核基因互作關(guān)系的闡明等仍有待繼續(xù)深入的研究。本研究以Rf3/rf3近等基因系S-MO17Rf3Rf3/S-MO17rf3rf3為材料，利用cDNAmicroarray和抑制性扣除雜交(SSH)技術(shù)，在轉(zhuǎn)錄水平上對玉米CMS-S核恢復(fù)

3、基因進行功能基因組學研究，得到以下初步結(jié)果： 1、在玉米S-Mo17Rf3Rf3生長的不同時期，分別提取不同組織的mRNA，構(gòu)建了玉米幼芽(含胚芽鞘)、三葉期幼苗(含根系)、淹水處理后的三葉期幼苗(含根系)、六葉期整株(含根系)、拔節(jié)期莖間居間生長組織、花藥、授粉5天后的雌穗和開花期成熟葉共8個cDNA文庫；等量混合各文庫的質(zhì)粒DNA，采用基因組DNA飽和雜交法進行均一化處理，構(gòu)建了一個含6×104個克隆的均一化cDNA文庫(M

4、ONL)。該文庫的插入片段在0.4kb～4.0kb之間，平均長度為1.18kb;71％的序列為uniqueESTs，12％以上的插入片段為現(xiàn)有核酸數(shù)據(jù)庫中所沒有同源序列的新序列，76％的插入序列為未知功能序列。cDNA克隆代表了多個組織和發(fā)育時期的RNA，且代表高豐度表達基因的cDNA克隆所占比例低，平均每個持家基因在文庫中的頻率約為0.4％，能在均一化文庫中檢測到低豐度表達基因的cDNA克隆。 2、將MONL文庫中的cDNA插

5、入片段進行PCR擴增，通過Agarose膠電泳檢測，將擴增質(zhì)量較好的10830個克隆的PCR產(chǎn)物，點制在尼龍膜上，制作cDNAmicroarray。使用5個組織的mRNA混合樣與cDNAmicroarray進行重復(fù)雜交實驗，檢測芯片質(zhì)量，結(jié)果表明，重復(fù)實驗的芯片間各對應(yīng)點的信號強度和芯片內(nèi)兩重復(fù)點的信號強度的重復(fù)性較好，R2分別為0.9728和0.965。 3、采用不連續(xù)蔗糖密度梯度離心，將不同發(fā)育狀態(tài)的小孢子和花粉分為沒有形成

6、液泡的小孢子(Y)，已形成多個小液泡的小孢子(SV)、形成了大液泡的小孢子(LV)和淀粉充實或敗育程度不同的花粉(SF1～SF3/CP1～CP3)。分別將3種發(fā)育狀態(tài)(SV、LV、SF1/CP1)的S-(Rf3)和S-(rf3)花粉mRNA反轉(zhuǎn)錄后與cDNAmicroarray雜交，結(jié)果顯示，(1)SV、LV和SF與cDNAmicroarray雜交的陽性克隆數(shù)分別為7611、7494和7105個。小液泡期的基因表達數(shù)目要比大液泡和花粉充

7、實期的基因表達數(shù)目要多(117個和506個)，大液泡發(fā)育期的基因表達數(shù)目比花粉充實時期的多(392個)，基因表達的數(shù)目從小液泡期到花粉充實期呈現(xiàn)逐步減少的趨勢，這一結(jié)果與不同發(fā)育時期小孢子和花粉內(nèi)實際的生理生化狀況相一致。(2)大液泡與花粉充實初期之間的基因表達差異最大，398個克隆存在4倍以上差異，占大約3.7％；大液泡期與小液泡期間，4倍以上差異表達的克隆有115個，占1.06％。(3)S-(Rf3)和S-(rf3)間，166個克隆

8、代表127個基因表現(xiàn)出4倍以上的差異。127個基因按功能可分為：花粉發(fā)育相關(guān)基因19個，占15％左右；信號轉(zhuǎn)導相關(guān)基因16個，占約13％；代謝相關(guān)基因19個，約占15％；與蛋白質(zhì)的合成和降解相關(guān)的基因16個，占13％；轉(zhuǎn)錄相關(guān)基因6個，占5％；物質(zhì)轉(zhuǎn)運相關(guān)基因5個，占4％；細胞防御和細胞凋亡相關(guān)基因9個，占7％；未知功能的序列27條，約占20％，其中新發(fā)現(xiàn)的序列10條，約占8％。 4、SSH分析發(fā)現(xiàn)了67個在S-(Rf3)和S-

9、(rf3)間差異表達的克隆，這些差異克隆代表13個基因，其中有3個基因(PG、expansin和allergen)與Microarray雜交結(jié)果相同。這些差異基因主要參與信號傳導、膜系統(tǒng)形成、花粉的成熟以及抗細胞衰老等生理活動，但沒有發(fā)現(xiàn)參與糖代謝、淀粉合成及其轉(zhuǎn)運相關(guān)基因。 5、4個抑制細胞凋亡基因(cystatin、Vdac2、BI-1和14-3-3)和2個細胞凋亡相關(guān)基因(Translationallycontrolled

10、tumorprotein-likeprotein和leaf-senescence-relatedprotein)及Ca2+信號和G蛋白信號傳導相關(guān)基因在S-(Rf3)和S-(rf3)間的表達表現(xiàn)出顯著差異。Northernblot的結(jié)果與芯片雜交的結(jié)果基本一致，并且cystatin、Vdac2、BI-1和14-3-3等具有時空特異性表達特性?；ㄋ幒突ǚ鄣腄NA電泳證實，與S-(Rf3Rf3)比較，S-(rf3rf3)花藥組織中DNA提前

11、出現(xiàn)DNA片段化，并且，S-(rf3)花粉中也存在以寡聚核糖體為單位的DNA片段化。在CMS-S花粉中，線粒體上的呼吸鏈相關(guān)基因如CoxⅡ、Cytochromec1、ATPsynthaseβ-subunit和Inorganicpyrophosphatase以及與H+傳遞相關(guān)基因Thioredoxinm2和Dihydroflavanoidreductase等異常表達，導致呼吸鏈中斷和線粒體功能異常。 6、比較基因組方法將15個感興

12、趣的玉米ESTs和基因序列中的6個被定位在玉米第二染色體上，這6個基因分別為PP2C、CDPK、CDPK-relatedproteinkinase、Tim9、S-AdoMetDC和Translationallycontrolledtumorprotein-likeprotein；另外，CDPK、CDPK-relatedproteinkinase、Tim9和Translationallycontrolledtumorprotein-lik

13、eprotein的DNA序列被定位在2.09bin，并且Translationallycontrolledtumorprotein-likeprotein、Tim9和CDPK的DNA序列定位在與Rf3緊密連鎖標記umc1525的兩側(cè)。 7、綜合以上分析結(jié)果，初步認為S-(rf3)花粉中，orf355/orf77的表達，作為一種PCD信號，誘導與呼吸鏈相關(guān)基因的異常表達，S-(，rf3)花粉細胞的呼吸鏈無法實現(xiàn)正常功能，花粉細胞能

14、量虧缺，最終導致線粒體結(jié)構(gòu)和功能的異常，進而激發(fā)由線粒體介導的細胞凋亡。Rf3的作用機理可能是通過Ca2+信號途徑和小G蛋白介導的信號途徑，調(diào)節(jié)細胞核和細胞質(zhì)基因(包括抑制細胞凋亡基因)轉(zhuǎn)錄本的積累，使得花粉正常發(fā)育途徑得以進行，從而恢復(fù)花粉育性。 克隆玉米對低氧脅迫早期響應(yīng)基因并研究其功能是本研究所關(guān)注的另一領(lǐng)域。漬害是南方玉米生產(chǎn)的重要制約因子，淹水對玉米傷害的實質(zhì)是厭氧脅迫。玉米在厭氧脅迫過程中，早期響應(yīng)基因的表達對后期厭

15、氧多肽(ANPs)的表達起著重要的調(diào)控作用，并直接影響著玉米對厭氧脅迫的代謝和形態(tài)適應(yīng)。因此，克隆玉米對低氧脅迫早期響應(yīng)基因并研究其功能，是當前玉米抗逆性遺傳研究的重要課題。本研究對淹水脅迫2h后玉米根系中基因表達譜進行了研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，151個克隆在對照與處理間存在2倍以上差異，其中，由于淹水處理而下調(diào)表達的克隆有37個，上調(diào)表達的有114個；32個克隆在對照與處理間存在3倍以上表達差異。這32個克隆代表24個非冗余基因，其主要功能涉

16、及到信號傳導、糖酵解、脂代謝、能量代謝、轉(zhuǎn)錄和蛋白質(zhì)合成等過程。另外，發(fā)現(xiàn)了3個新的受淹水誘導表達cDNA片段，并提交到了DNADataBase(CF569035～CF569037)。通過RACE擴增，得到了1條玉米類鋅指蛋白(ZmZF)的全長cDNA(AY515607)。Northern分析也證明該基因在淹水處理的玉米根系被高效誘導表達。生物信息學分析說明該基因所編碼的蛋白可能參與蛋白質(zhì)合成的起始。綜合分析在淹水脅迫后SKP1/ASK