旱柳半胱氨酸蛋白酶基因克隆及鹽脅迫響應功能分析.pdf

1、旱柳是一種耐鹽耐旱的植物。本文以旱柳為材料，采用生物信息學、RT-qPCR、基因克隆等技術(shù)，得到了旱柳SmCP基因cDNA及基因組全長，分析其基因功能，得出結(jié)論如下：
　　1）從旱柳cDNA文庫中篩選出一個耐鹽相關(guān)的半胱氨酸蛋白酶基因，通過PCR克隆獲得旱柳SmCP基因cDNA全長和基因組DNA全長。生物信息學軟件分析得知該基因含有8個外顯子，7個內(nèi)含子，編碼359個氨基酸。同時該蛋白具有木瓜蛋白酶家族保守的結(jié)構(gòu)域：inhibit

2、or-I29和peptidase-C1A，與其他木瓜蛋白酶家族一樣，N末端有1個信號肽結(jié)構(gòu)，同時還有1個跨膜結(jié)構(gòu)，屬于跨膜蛋白。
　　2）亞細胞定位預測顯示該基因位于液泡中；進化樹分析表明該基因與毛果楊PtCP親緣關(guān)系最近。啟動子元件預測顯示該基因啟動子區(qū)包含熱脅迫、干旱脅迫、抗氧化響應元件HSE、MBS、ARE，同時還含有茉莉酸甲酯、水楊酸、生長素、赤霉素響應元件MeJA、TCA-element、TGA-element、TATC

3、-box，表明SmCP極有可能參與了這些逆境脅迫的響應。
　　3）分別提取不同鹽處理時間旱柳的根莖葉的RNA，利用RT-qPCR進行旱柳SmCP組織特異性時空表達模式分析。結(jié)果顯示SmCP在旱柳根莖葉中都有表達，在葉中表達量最高，根和莖中表達量差異不大。在鹽脅迫的96小時的過程中，SmCP在根莖葉中動態(tài)表達的。莖中表達趨勢不明顯，在葉中，脅迫24h的過程中，SmCP表達量逐漸升高，24h達到巔峰值，隨后下降。在根中，表達量在48h

4、時急劇升高，在96h表達量是0h的8倍左右。
　　4）構(gòu)建SmCP的原核表達載體pYES2.1-SmCP，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21 Star（DE3），1M NaCl脅迫條件下進行點板實驗及繪制生長曲線，結(jié)果顯示SmCP基因的轉(zhuǎn)化子生長狀態(tài)都優(yōu)于空載，證明SmCP的導入提高了大腸桿菌耐鹽性。
　　5）構(gòu)建的植物表達載體pCAMBIA2300-SmCP轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌，侵染擬南芥，鑒定得到陽性表達植株。隨后對轉(zhuǎn)基因植株及野生型擬南芥鹽脅