水稻W(wǎng)RKY基因的克隆和功能分析.pdf

1、植物WRKY轉(zhuǎn)錄因子家族在植物抗逆反應(yīng)中起著廣泛而重要的調(diào)控作用。為了探討水稻轉(zhuǎn)錄因子基因(Os WRKY)在水稻應(yīng)對生物脅迫和非生物脅迫中所擔(dān)負(fù)的獨(dú)特生物學(xué)功能，我們通過反轉(zhuǎn)錄PCR方法克隆獲得OsWRKY19、OsWRKY21、OsWRKY45；OsWRKY24、OsWRKY30、OsWRKY70；OsWRKY28、OsWRKY62、OsWRKY71、OsWRKY76；OsWRKY1、OsWRKY97這四個(gè)亞組12個(gè)基因的全長cDN

2、A序列。然后，分別構(gòu)建完成相應(yīng)基因的植物過量表達(dá)載體12個(gè)和RNAi基因沉默載體12個(gè)，用于水稻轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)。并且，應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)初步分析了上述OsWRKY基因在7種逆境因子脅迫下的基因表達(dá)譜，結(jié)果表明：OsWRKY19、OsWRKY45、OsWRKY62和OsWRKY76的表達(dá)受水楊酸和BTH誘導(dǎo)都能顯著上調(diào)，OsWRKY28經(jīng)茉莉酸誘導(dǎo)后表達(dá)顯著上調(diào)，OsWRKY24和OsWRKY70的表達(dá)受冷脅迫上調(diào)明顯。 對Os

3、WRKY21基因表達(dá)譜進(jìn)行了更廣泛的分析，發(fā)現(xiàn)低pH值的模擬酸雨(AR2.5-3.5)處理能夠強(qiáng)烈地誘導(dǎo)OsWRKY21的表達(dá)。繼而，對OsWRKY21轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行了酸雨耐受試驗(yàn)，離體葉片檢測表明：用低pH值A(chǔ)R溶液處理時(shí)，T1代過量表達(dá)植株比野生型植株更能抵抗酸雨的傷害，而T1代RNAi植株則比野生型植株更易受酸阿的傷害。進(jìn)一步使用低pH值A(chǔ)R溶液噴施T2代轉(zhuǎn)基因純系植株，葉面酸蝕斑面積的統(tǒng)計(jì)分析再次證明OsWRKY21過量表達(dá)能夠

4、顯著提高水稻對酸雨的抵抗能力，而OsWRKY21基因沉默導(dǎo)致水稻對酸雨耐受力明顯下降。這些結(jié)果顯示OsWRKY21在水稻應(yīng)對酸雨脅迫過程中起著重要的正調(diào)控作用。此外，干旱實(shí)驗(yàn)也表明OsWRKY21過量表達(dá)可以增強(qiáng)水稻對干旱的耐受性。 為尋找OsWRKY21調(diào)控的下游靶基因，我們采用pull down技術(shù)獲得OsWRKY21蛋白結(jié)合的DNA片段，經(jīng)測序確認(rèn)基因信息后，選擇其中48個(gè)基因進(jìn)行RT—PCR篩選，繼而使用Real—tim

5、e PCR技術(shù)推斷一個(gè)胚胎形成跨膜蛋白(embryogenesis transmembrane protein，ETP)和一個(gè)受體蛋白激酶CLAVATA1(receptor protein kinase CLAVATA1，RPKC)為OsWRKY21調(diào)控的下游靶基因。OsWRKY21能夠激活胚胎形成跨膜蛋白的表達(dá)并抑制受體蛋白激酶CLAVATA1的表達(dá)。 綜上所述，本論文對12個(gè)OsWRKY基因的克隆、載體構(gòu)建和表達(dá)譜分析為后續(xù)