豬病毒性腹瀉病原相關(guān)蛋白在植物系統(tǒng)中的表達.pdf

1、豬病毒性腹瀉是我國豬場常見的多發(fā)病，其主要病原有豬流行性腹瀉病毒(PEDV)、豬輪狀病毒(PRV)和豬傳染性腸胃炎病毒(TGEV)。該類疾病的傳染率和致死率都很高，同時各年齡階段的豬均有感染的危險，嚴重威脅了養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展，因此研究有效的相關(guān)疫苗具有重要意義。本試驗在前期關(guān)于PRV病毒VP7蛋白在煙草中表達的基礎(chǔ)上進行更深入的探索，以煙草瞬時表達系統(tǒng)、煙草穩(wěn)定表達系統(tǒng)和玉米胚乳特異性表達系統(tǒng)作為生物反應(yīng)器，分別構(gòu)建這幾種病毒相關(guān)抗原蛋白的

2、重組表達載體，采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)入受體植物材料，并進行蛋白表達檢測，為進一步開發(fā)植物源病毒疫苗奠定基礎(chǔ)。
　　試驗主要取得以下結(jié)果:
　　(1)選取PEDV病毒纖突蛋白S上的主要抗原位點所在區(qū)域248-789位氨基酸，用煙草核偏愛密碼子進行優(yōu)化并由公司合成基因。根據(jù)受體植物材料不同，分別選取植物35S啟動子和玉米14kD Zein啟動子，成功構(gòu)建了pBI121-S植物表達載體和pBI121-pZein∷S玉米胚乳特異性表達載

3、體。用電擊法將載體轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌GV3101中，再用農(nóng)桿菌侵染法構(gòu)建植物轉(zhuǎn)基因再生體系，分別將S基因轉(zhuǎn)入普通煙草葉盤和玉米胚乳愈傷組織中。經(jīng)篩選和誘導(dǎo)培養(yǎng)，獲得再生抗性植株。
　　(2)以普通煙草為材料，用優(yōu)化的瞬時表達系統(tǒng)對PRV病毒中和抗原和血凝素抗原的融合蛋白VP4-7進行轉(zhuǎn)化，提取侵染后的煙草總蛋白并用鎳柱純化，純化前后的蛋白我們分別進行了SDS-PAGE和Western Blot分析。用His-tag抗體進行檢測，總蛋白We