YMO1通過RhoC信號通路抑制肝細胞癌侵襲轉移的研究.pdf

1、原發(fā)性肝細胞癌(HCC)是一種臨床最為常見的惡性腫瘤。隨著肝臟外科技術的發(fā)展，肝癌的手術切除率不斷提高，但其術后轉移復發(fā)率仍居高不下，導致其整體療效仍無顯著改善。因此，肝癌術后的轉移復發(fā)已成為嚴重制約提高肝癌長期生存率的主要障礙。深入研究肝癌高侵襲轉移，有助于弄清肝癌復發(fā)轉移的的分子機制。探索有效的預防和治療復發(fā)轉移的手段是肝癌研究領域中的重要科學問題，對于進一步提高肝癌患者術后整體治療水平具有重要意義。
　　嵌合體眼狀蛋白1（Y

2、MO1），又名EPB41 L5，是新近發(fā)現(xiàn)的與胚胎原腸胚發(fā)育的蛋白，廣泛表達于哺乳動物胚胎中、內胚層上皮組織。鑒于其具有調節(jié)細胞肌動蛋白骨架，調節(jié)細胞粘附分子，基底膜形成及細胞極性等功能，且在胚胎中的定位與成體肝臟一致，提示YMO1可能參與了肝癌侵襲轉移過程。因此，本課題在研究YMO1在肝癌組織樣本及肝癌細胞系中表達情況的基礎上，結合臨床隨訪病例分析YMO1與預后的關系，并通過構建YMO1過表達質粒，在細胞系中上調YMO1的表達，綜合運

3、用一系列功能學方法從體外和體內兩個層面研究了YMO1調控HCC侵襲轉移的分子機制，同時探討YMO1抑制HCC侵襲轉移的分子機制。研究結果顯示:
　　1、YMO1 mRNA和蛋白在HCC組織中均呈低表達:首先在前期的預實驗中，采用實時定量PCR對30例肝癌組織及相應癌旁組織對4.1蛋白家族的7個成員4.1R(EPB41)、4.1N(EPB41L1)、4.1G(EPB41L2)、4.1B(EPB41L3)、NBL4(EPB41L4A)

4、、EHM2(EPB41L4B)、YMO1(EPB41L5)的mRNA的表達水平進行定量檢測。結果顯示YMO1在肝癌組織中的表達下調。采用RT-PCR、Realtime PCR和Westem blot等方法檢測了30例新鮮肝癌組織及相應的鄰近非癌肝組織以及6例正常肝組織中YMO1 mRNA和蛋白的表達水平，結果發(fā)現(xiàn)YMO1 mRNA和蛋白在肝癌組織中表達明顯低于鄰近非癌肝組織。孤立性大肝癌(SLHCC)和小肝癌(SHCC)中的YMO1 m

5、RNA和蛋白表達水平明顯高于結節(jié)性肝癌(NHCC)。繼之又采用RT-PCR及Western blot檢測正常肝細胞LO2細胞系及HepG2、MHCC97-L、MHCC97-H和HCCLM3四種侵襲轉移潛能依次升高的肝癌細胞系中的YMO1 mRNA和蛋白的表達水平，結果顯示YMO1 mRNA和蛋白在L02細胞系中顯著高于其他肝癌細胞系;且其表達水平在HepG2、MHCC97-L、MHCC97-H和HCCLM3細胞中依次降低，提示YMO1的

6、低表達與肝癌細胞的侵襲轉移潛能密切相關。
　　2、YMO1低表達與肝癌臨床病理特征及預后的關系:采用免疫組化法檢測155例HCC組織中YMO1的表達，結果顯示YMO1主要分布于胞漿內及胞膜，肝癌組織中YMO1蛋白陽性表達率(63/155，40.6％)明顯低于鄰近非癌肝組織(131/155，84.5％)，且其表達水平與肝癌結節(jié)個數、有無包膜及有無靜脈浸潤等臨床病理特征相關。同時，YMO1低表達組的無瘤生存時間及總體生存時間均明顯短于

7、YMO1高表達組。多因素分析顯示YMO1低表達與結節(jié)數目和靜脈浸潤是預測肝癌預后的獨立危險因素，提示YMO1的低表達預示肝癌患者不良預后。
　　3、YMO1在體外能顯著抑制肝癌細胞的遷移運動能力而不影響肝癌細胞的增殖:構建了pcDNA3-YMO1過表達質粒，使用Lipofactamine LTX轉染HCCLM3細胞系。經過G418篩選獲得了穩(wěn)定表達YMO1細胞系HCCLM3YMO1+和空質粒對照組HCCLM3vector細胞，并采

8、用RT-PCR和Western blot方法驗證YMO1的表達效率。劃痕愈合實驗結果顯示 HCCLM3YMO1+遷移運動能力較HCCLM3vector細胞明顯減弱;Transwell實驗結果進一步顯示HCCLM3YMO1+細胞侵襲能力較HCCLM3vector細胞的明顯下降;HCCLM3YMO1+細胞的同質性粘附能力較HCCLM3vector細胞明顯增強而異質性粘附能力明顯減弱。而細胞生長曲線結果則顯示HCCLM3YMO1+與HCCLM

9、3vector細胞的增殖能力無明顯區(qū)別，表明上調YMO1的表達可顯著抑制肝癌細胞的侵襲運動能力而對其增殖能力并無影響。
　　4、YMO1能抑制肝癌的體內成瘤能力并降低肝內與肺轉移率:建立了人肝癌細胞裸鼠皮下成瘤模型及人肝癌細胞裸鼠肝臟原位種植瘤模型，旨在體內進一步驗證YMO1的功能。結果顯示，HCCLM3YMO1+組皮下種植瘤成瘤率和腫瘤大小均小于HCCLM3vector組;原位肝臟種植瘤的平均直徑HCCLM3YMO1+組明顯小于

10、HCCLM3vector組，且其肝內轉移率和肺轉移率明顯降低，由此清楚地表明上調YMO1后不但在體內能夠明顯抑制肝癌細胞的成瘤能力，而且其侵襲轉移能力也受到明顯抑制。
　　5、YMO1通過下調RhoC抑制肝癌侵襲轉移:已有研究顯示YMO1蛋白含有一個可以調控G蛋白磷酸化過程的PDZ結構域。鑒于RhoGTP酶家族蛋白是通過參與G蛋白磷酸化來影響細胞遷移運動，選取了一系列經典的RhoGTP酶分子進行免疫共沉淀篩選。結果顯示，在選取的一

11、系列RhoGTP酶分子中，HCCLM3YMO1+細胞中的RhoC和YMO1蛋白有共沉淀，提示YMO1與RhoC存在直接的相互作用。接著在過表達YMO1的HCCLM3YMO1+細胞系中轉染pEGFP-C1-RhoC過表達質粒，以HCCLM3YMO1+和HCCLM3vector作為對照，采用Westem blot檢測了RhoC蛋白的表達水平，pulldown實驗檢測RhoC的GTP酶活性，劃痕愈合實驗檢測遷移運動能力，Transwell實驗

12、檢測侵襲能力，免疫熒光檢測細胞骨架。結果顯示，HCCLM3細胞系在轉染pcDNA3-YMO1后，RhoC蛋白表達水平及GTP酶活性明顯下降，侵襲及運動遷移能力減弱，細胞骨架趨于規(guī)整。而共轉染pcDNA3-YMO1與pEGFP-C1-RhoC過表達質粒組與HCCLM3vector細胞系組無區(qū)別。結果明顯提示，YMO1是通過抑制調控RhoC活性來抑制肝癌的侵襲轉移。用Western blot檢測ROCK1、PTEN、AKT、FAK、、 ER

13、K1/2的蛋白表達和蛋白磷酸化水平，結果顯示，HCCLM3YMO1+細胞中，ROCK1的表達以及p-PTEN、p-AKT、p-FAK和p-ERK磷酸化水平明顯下調，PTEN、AKT、FAK、ERK1/2的蛋白表達在HCCLM3vector細胞系、HCCLM3YMO1+細胞系以及HCCLM3YMO1+RhoC三組細胞系中均無明顯差別。
　　6．YMO1在肝癌中的表達受轉錄因子PAX5調控:利用SABiosciences的DECODE

14、轉錄因子數據庫對YMO1的啟動子序列進行分析，推測PAX5可能是調控YMO1表達的上游轉錄因子。通過雙熒光素酶報告基因系統(tǒng)、染色質免疫共沉淀技術(ChIP)以及Western blot等方法進行驗證，結果證實，轉錄因子PAX5可以與YMO1的啟動子序列的直接結合，并且PAX5對于YMO1的表達有上調作用。進一步通過對155例免疫組化的分析，證明在肝癌組織中YMO1與PAX5均呈低表達，且二者的表達水平呈正相關;而YMO1在肝癌組織中呈低