Tomoregulin-1通過TAK1-JNK信號通路抑制壓力負荷引起的心肌肥厚.pdf

1、第一部分Tomoregulin-1通過TAK1-JNK信號通路抑制壓力負荷引起的心肌肥厚
　　背景: 肥厚型心肌病是一類以左心室和/或右心室肥厚為主要特征的可遺傳的心肌疾病，是誘發(fā)猝死、心力衰竭和中風的重要危險因素之一?，F(xiàn)階段，關于肥厚型心肌病的分子病理生理的基礎研究仍較少，確定參與肥厚型心肌病病理發(fā)生發(fā)展的重要修飾基因對開展肥厚型心肌病新的治療方法至關重要。Tomoregulin-1是新近發(fā)現(xiàn)的一個生長因子，主要參與胚胎中后期發(fā)

2、育的調控和成體中樞神經系統(tǒng)正常功能的維持，在多種中樞神經系統(tǒng)疾病中表達異常。Tomoregulin-1在心臟組織中亦表達，并能夠和參與心臟發(fā)育的Cripto相結合。本實驗室基因芯片結果發(fā)現(xiàn)，Tomoregulin-1在遺傳性肥厚型心肌病cTnTR92Q轉基因小鼠的心臟組織中表達增高。但目前尚無有關Tomoregulin-1在心臟中的功能，尤其是在肥厚型心肌病中的功能研究。因此，本文旨在通過建立Tomoregulin-1沉默和Tomore

3、gulin-1過表達轉基因小鼠，分析Tomoregulin-1對肥厚型心肌病的調節(jié)作用及可能的分子機制。
　　方法: (1) Tomoregulin-1于野生型和肥厚型心肌病小鼠心臟組織中的定位和表達:免疫熒光觀察Tomoregulin-1于野生型C57BL/6J小鼠心臟組織中的定位;Westernblot檢測Tomoregulin-1于野生型C57BL/6J小鼠心臟組織中的時程表達變化和Tomoregulin-1于遺傳性肥厚型心

4、肌?。╟TnTR92Q轉基因小鼠）及壓力負荷致肥厚型心肌?。ㄖ鲃用}縮窄，thoracic aorta constriction，TAC）小鼠心臟組織中的表達變化。
　　(2)心臟組織特異Tomoregulin-1沉默C57BL/6J小鼠和Tomoregulin-1過表達轉基因C57BL/6J小鼠的建立:分別將靶向Tomoregulin-1基因的siRNA和鼠源Tomoregulin-1基因插入α-MHC啟動子下游，構建表達載體，通

5、過顯微注射法建立心臟組織特異Tomoregulin-1沉默C57BL/6J小鼠和Tomoregulin-1過表達轉基因C57BL/6J小鼠。PCR鑒定Tomoregulin-1沉默小鼠和Tomoregulin-1過表達轉基因小鼠的基因型，Western blot檢測Tomoregulin-1的表達，分別篩選Tomoregulin-1沉默和Tomoregulin-1過表達轉基因首建鼠進行繁殖培育，穩(wěn)定傳代后，子代小鼠用于本文實驗。

6、　　(3)正常生理情況下，心臟組織特異Tomoregulin-1沉默C57BL/6J小鼠和Tomoregulin-1過表達轉基因C57BL/6J小鼠心臟形態(tài)和功能的表型分析:M型超聲心動圖于1、3、5和7月齡檢測同窩陰性小鼠、Tomoregulin-1沉默小鼠和Tomoregulin-1過表達轉基因小鼠正常生理情況下心臟的結構形態(tài)和功能。
　　(4)壓力負荷刺激情況下，心臟組織特異Tomoregulin-1沉默C57BL/6J小鼠

7、和Tomoregulin-1過表達轉基因C57BL/6J小鼠的表型分析與分子機制探究:于8-10周齡，分別對同窩陰性小鼠、Tomoregulin-1沉默小鼠和Tomoregulin-1過表達轉基因小鼠進行TAC，同時設假手術對照組（sham組）。于術后4周，記錄sham和TAC組中同窩陰性小鼠、Tomoregulin-1沉默小鼠和Tomoregulin-1過表達轉基因小鼠的生存狀況，M型超聲心動圖檢測小鼠心臟的結構形態(tài)和功能變化，計算心

8、臟重量與體重的比值評價心肌肥厚程度，病理組織學染色觀察小鼠心臟組織學改變，實時定量PCR檢測反映心肌間質膠原成分的Ⅲ型膠原α1（Col3α1）的表達變化。Westemblot檢測sham和TAC組中同窩陰性小鼠、Tomoregulin-1沉默小鼠和Tomoregulin-1過表達轉基因小鼠心臟組織中包括轉化生長因子2型受體（TGFβ type2 receptor，TβR2）、轉化生長因子1型受體（TGFβ type1 receptor，

9、TβR2）、轉化生長因子激活激酶1（TGFβ-activated kinase1，TAK1）和c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminalkinase，JNK)等與心肌肥厚相關的因子的表達變化。
　　結果: (1) Tomoregulin-1定位于野生型小鼠的心肌細胞而非心臟成纖維細胞。隨著年齡的增加，Tomoregulin-1在野生型小鼠心臟組織中表達水平逐漸增高;且在遺傳性（cTnTR92Q轉基因小鼠）及壓力負荷(

10、TAC)致肥厚型心肌病小鼠模型心臟組織中表達增高。
　　(2)分別建立了2個系的心臟組織特異的Tomoregulin-1低表達沉默小鼠和Tomoregulin-1高表達轉基因小鼠。
　　(3)正常生理情況下，M型超聲心動圖顯示，與同窩陰性小鼠相比，心臟組織特異Tomoregulin-1沉默小鼠在1、3、5和7月齡時心臟均呈現(xiàn)室壁變薄，心腔增大，心收縮功能減退的表型;心臟組織特異Tomoregulin-1過表達轉基因小鼠在5月

11、齡之前心臟均呈現(xiàn)室壁增厚，心腔縮小，心收縮功能增強的表型，在5月齡之后，與同窩陰性小鼠相比，Tomoregulin-1過表達轉基因小鼠心臟室壁增厚不明顯。
　　(4)壓力負荷刺激情況下，生存率分析顯示，sham組的同窩陰性小鼠、Tomoregulin-1沉默小鼠和Tomoregulin-1過表達轉基因小鼠的生存率均為100％; TAC組，與同窩陰性小鼠相比，Tomoregulin-1沉默小鼠的術后4周生存率顯著降低，僅為66.7％

12、，而Tomoregulin-1過表達轉基因小鼠的生存率為84.6％，顯著高于同窩陰性小鼠。M型超聲心動圖顯示，Tomoregulin-1沉默小鼠因壓力負荷致心臟室壁增厚程度顯著高于同窩陰性小鼠，而Tomoregulin-1過表達轉基因小鼠心臟室壁增厚得到明顯改善。同時，因代償增加的心收縮功能亦顯著低于同窩陰性小鼠。與同窩陰性小鼠相比，Tomoregulin-1沉默小鼠因壓力負荷致心臟重量與體重的比值顯著升高，而Tomoregulin-1

13、過表達轉基因小鼠心肌肥厚程度顯著減少。病理組織學染色可見 Tomoregulin-1沉默小鼠心肌細胞排列紊亂和間質纖維化程度均顯著高于同窩陰性小鼠，而過表達Tomoregulin-1顯著改善了壓力負荷導致的病理組織學改變。反映心肌間質膠原成分的Col3α1在Tomoregulin-1沉默小鼠中的表達顯著增加，Col3α1的病理性增加在Tomoregulin-1過表達轉基因小鼠中得到抑制。與心肌肥厚相關的TβR1、TAK1和JNK在Tom

14、oregulin-1沉默小鼠心臟組織中均被激活，且經過壓力負荷病理刺激后，激活程度更加明顯;而過表達Tomoregulin-1在生理和病理情況下均可顯著抑制TβR1、TAK1和JNK的激活。
　　結論: 過表達Tomoregulin-1可顯著改善壓力負荷引起的心肌肥厚，降低Tomoregulin-1的表達可加速心肌肥厚的病理進程;心肌細胞中的TAK1-JNK信號通路參與Tomoregulin-1對壓力負荷引起的心肌肥厚的保護性調節(jié)

15、過程。Tomoregulin-1可能是肥厚型心肌病調節(jié)的重要修飾基因，為臨床肥厚型心肌病的治療提供新的研究思路和方向。
　　第二部分利用CRISPR/Cas9技術建立的瘦素受體基因敲除大鼠表型的系統(tǒng)分析
　　背景: 隨著人們生活水平的提高，物質條件的改善，全球肥胖的患病率和發(fā)生率迅速增加，肥胖已成為全球性流行病。肥胖能引起甚多疾病，如2型糖尿病、高膽固醇血癥、高血壓或心臟病，與死亡率的增加和平均壽命的減少直接相關。人類基因組

16、計劃的完成，大量與肥胖、糖尿病等疾病相關的基因陸續(xù)被人們發(fā)現(xiàn)，瘦素受體(leptin receptor, Lepr)便是其中之一。Lepr由糖尿病(diabetes，db)基因編碼，于脈絡叢中高表達。Lepr與其配體leptin結合啟動調節(jié)攝食和機體的能量平衡。Lepr缺失或leptin缺失，均會導致肥胖的發(fā)生，并出現(xiàn)不同程度糖尿病臨床表現(xiàn)。目前，已有多種Lepr基因相關的嚙齒類動物模型應用于肥胖、糖尿病的研究，但現(xiàn)階段的動物模型均存在

17、一定的不足，如Lepr缺失的小鼠（db/db小鼠，C57BL/6J背景）表現(xiàn)出一過性高血糖，Lepr缺失的大鼠(Zucker大鼠，a/fa大鼠)葡萄糖耐受受損表型出現(xiàn)遲緩等，不能完全復制人類糖尿病的所有臨床表現(xiàn)。所以，建立更理想的肥胖、糖尿病等代謝疾病的動物模型，對防治藥物的研發(fā)具有重大的臨床價值和社會意義。
　　方法: 利用常間回文重復序列叢集/常間回文重復系列叢集關聯(lián)蛋白9技術(clustered regularly inte

18、rspaced short palindromic repeats/ CRISPR-associated9,CRISPR/Cas9)建立Lepr基因敲除大鼠:針對Lepr基因第四個外顯子設計并合成兩個寡聚核苷酸鏈，構建gRNA表達載體，將體外轉錄好的Cas9 mRNA(20ng/μl)和gRNA(每個gRNA10ng/μl)的混合物通過顯微注射法注入Sprague Dawley(SD)大鼠受精卵中，共產生8只大鼠。PCR鑒定Lepr基因

19、敲除大鼠的基因型，TA克隆、測序進一步檢測確定Lepr敲除情況，Western blot檢測LEPR的表達，篩選Lepr基因敲除首建鼠進行繁殖培育，穩(wěn)定傳代后，子代的大鼠用于本文實驗。于1-8月齡分別檢測雄性和雌性同窩陰性大鼠和Lepr基因敲除純合子（Lepr-/-）大鼠體重、平均攝食量、空腹血糖和隨機血糖。于2、4和8月齡分別對雄性和雌性同窩陰性大鼠和Lepr-/-大鼠進行腹腔葡萄糖耐受實驗，同時測定葡萄糖刺激下的胰島素水平。于2、4

20、和8月齡分別對雄性和雌性同窩陰性大鼠和Lepr-/-大鼠進行血生化指標測定，測定指標為:甘油三酯、總膽固醇、高密度膽固醇和低密度膽固醇。病理組織學染色觀察2、4和8月齡同窩陰性大鼠和Lepr-/-大鼠胰臟、肝臟、腎臟和脂肪組織的組織學改變。微型計算機斷層掃描分析8月齡同窩陰性大鼠和Lepr-/-大鼠的股骨遠端骨小梁結構和骨結構相關參數，如骨體積/全部組織體積、骨小梁的數量、骨小梁間隙、骨小梁硬度和骨密度。
　　結果: 利用CRIS

21、PR/Cas9技術，通過顯微注射法共產生8只大鼠。經PCR鑒定、TA克隆和測序分析后，篩選出Lepr基因敲除298個堿基、插入4個堿基的2號大鼠作為首建鼠進行繁殖培育。Western blot檢測Lepr-/-大鼠肝臟中無LEPR表達。Lepr-/-大鼠于1月齡出現(xiàn)嚴重的早期肥胖，至8月齡時，雄性和雌性Lepr-/-大鼠的體重分別是同窩陰性大鼠的1.6倍和2.6倍;體重的增加伴隨著攝食量的顯著增加。雄性Lepr-/-大鼠于4月齡出現(xiàn)空腹

22、血糖增高，并持續(xù)至8月齡;于2月齡出現(xiàn)隨機血糖增高，于4月齡達到峰值，是同窩陰性大鼠隨機血糖值的2.64倍;雌性Lepr-/-大鼠的空腹血糖和隨機血糖值均近乎正常水平。雄性Lepr-/-大鼠于2月齡出現(xiàn)明顯的葡萄糖耐受受損，隨年齡增大，受損程度逐漸增加，直至8月齡;雌性Lepr-/-大鼠僅于4月齡出現(xiàn)明顯的葡萄糖耐受受損。雄性和雌性Lepr-/-大鼠于2、4和8月齡均出現(xiàn)高胰島素血癥、高膽固醇血癥等脂質代謝紊亂。病理組織學染色顯示，與同

23、窩陰性大鼠相比，Lepr-/-大鼠胰島出現(xiàn)明顯的空泡、肥大、纖維化和出血;嚴重的肝臟脂肪變性;脂肪細胞體積顯著增大;腎小球基質擴張，部分腎小球硬化，腎小管擴張和再生。8月齡的Lepr-/-大鼠，與同窩陰性大鼠相比，其股骨遠端的骨體積/全部組織體積顯著減小，骨小梁數量顯著減少，骨小梁間隙顯著增加，骨密度顯著減小。
　　結論: 利用CRISPR/Cas9技術成功建立Lepr基因敲除大鼠，并表現(xiàn)出明顯的肥胖、食欲過盛、血糖升高、葡萄糖耐