硒結(jié)合蛋白1(SBP1)抑制肝細(xì)胞癌侵襲和轉(zhuǎn)移的機(jī)制研究.pdf

1、肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)在全球常見惡性腫瘤中居第六位，在腫瘤相關(guān)性死亡中居第三位。雖然目前在肝癌的早期診斷、手術(shù)切除及肝臟移植方面取得了諸多進(jìn)步，肝癌患者的生存率得到很大的提高，但是仍然只有30％～40％的患者適宜行根治性手術(shù)。而且即使是根治性切除，5年內(nèi)仍有60％～70％的患者出現(xiàn)復(fù)發(fā)與轉(zhuǎn)移。因此，探索肝癌發(fā)生發(fā)展及復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的機(jī)制，尋找有效的抑制途徑與方法，已成為提高肝癌生存率的關(guān)鍵。

2、>　　硒(Selenium)是一種重要的微量元素，它對(duì)腫瘤的預(yù)防與抑制作用已經(jīng)被很多研究所證實(shí)。含硒蛋白(selenium containing proteins)是硒元素在體內(nèi)的存在形式，不同的含硒蛋白有著截然不同的物化特性與生理功能。其中，硒結(jié)合蛋白1(Selenium-binding protein1，SBP1)被認(rèn)為是硒元素抑癌作用的重要載體。研究已經(jīng)表明許多腫瘤組織中的SBP1表達(dá)水平低于正常組織，并且與腫瘤的不良預(yù)后密切相關(guān)

3、。但是SBP1在原發(fā)性肝癌發(fā)展預(yù)后中的作用尚無相關(guān)研究，其抑癌作用的可能機(jī)制也鮮有提及。
　　谷胱甘肽過氧化物酶(Glutathione peroxidase1，GPX1)是另一種重要的含硒蛋白，它的抗氧化作用可以保護(hù)細(xì)胞免受氧自由基的損害，大量的研究表明它對(duì)腫瘤細(xì)胞也有著相同的保護(hù)作用。以往的研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了SBP1與GPX1之間可能存在一定的相互作用，但是并未深入探討其在腫瘤發(fā)展過程中所起到的作用。另一方面，SBP1的表達(dá)受到缺

4、氧誘導(dǎo)因子-1α(hypoxia-inducible factor-1α，H1F-1α)的調(diào)控，HIF-1α是細(xì)胞面對(duì)缺氧、氧應(yīng)激時(shí)重要的應(yīng)答因子，它在腫瘤的進(jìn)展過程中有著復(fù)雜的生物學(xué)功能。GPX1、HIF-1α與SBP1之間的相互聯(lián)系是否與其抑癌作用相關(guān)，值得我們的研究。
　　本研究中，我們通過比較不同惡性程度及侵襲能力的人肝癌細(xì)胞系中SBP1表達(dá)的情況，利用siRNA技術(shù)研究SBP1在肝癌細(xì)胞侵襲、遷移、增殖及凋亡過程中的作用

5、，進(jìn)一步探討了SBP1抑癌作用的可能分子機(jī)制，并通過臨床標(biāo)本加以證實(shí)。最后，通過組織芯片技術(shù)，在大規(guī)模樣本群中研究SBP1在肝癌組織中的表達(dá)情況及其與臨床預(yù)后的關(guān)系，探討其對(duì)臨床實(shí)踐的意義與作用。
　　第一部分SBP1在人肝癌細(xì)胞系中的表達(dá)情況及其對(duì)肝癌細(xì)胞的抑制作用
　　本部分旨在研究SBP1在人正常肝細(xì)胞系和肝癌細(xì)胞系的表達(dá)情況，并通過一系列體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)SBP1對(duì)肝癌細(xì)胞的抑制作用。選用正常肝細(xì)胞系L-02和Hep3B、

6、HepG2、Huh7、SMMC7721、PLC/PRF/5、MHCC97-L、MHCC97-H、HCCLM3和HCCLM6共9種不同的人肝癌細(xì)胞系，通過Western blot方法檢測上述細(xì)胞系中SBP1的表達(dá)情況;從中選取SBP1高表達(dá)的肝癌細(xì)胞株SMMC7721，利用siRNA方法建立敲低組與對(duì)照組，并利用Real-time PCR、Western blot、免疫熒光等方法加以證實(shí);通過一系列體外實(shí)驗(yàn)研究SBP1敲低組與對(duì)照組之間不

7、同的生物學(xué)特性。
　　結(jié)果發(fā)現(xiàn)SBP1在正常肝細(xì)胞系中高表達(dá)，而在肝癌細(xì)胞系中，除SMMC7721外，均表現(xiàn)為低表達(dá)，尤其在高轉(zhuǎn)移潛能的細(xì)胞系中幾乎不表達(dá)。進(jìn)一步的體外實(shí)驗(yàn)表明SBP1可以抑制腫瘤細(xì)胞的遷移，但是僅在過氧化氫處理的情況下表現(xiàn)出對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖的抑制作用和對(duì)其凋亡的促進(jìn)作用。
　　研究表明，正常肝細(xì)胞高表達(dá)SBP1而大部分肝癌細(xì)胞系普遍低表達(dá)。減少SBP1的表達(dá)可以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的遷移，同時(shí)幫助腫瘤細(xì)胞在過氧化氫處

8、理的情況下保持增殖能力并且逃避凋亡。而在正常情況下SBP1并不表現(xiàn)出這樣的作用，說明其抑癌作用可能與其對(duì)活性氧自由基(Reactive Oxygen Species，ROS)的調(diào)節(jié)有關(guān)。
　　第二部分SBP1抑制肝癌細(xì)胞增殖、促進(jìn)其凋亡的機(jī)制以及SBP1、GPX1與HIF-1α之間的相互作用
　　本部分旨在探討SBP1在特定條件下抑制腫瘤增殖、促進(jìn)其凋亡的機(jī)制并建立起SBP1、GPX1與HIF-1α之間的相互作用關(guān)系。我們通

9、過Western blot方法檢測正常條件下與過氧化氫處理下各組別SMMC7721細(xì)胞中SBP1、GPX1、HIF-1α的表達(dá)水平;利用酶活性試劑盒測定不同組別不同處理?xiàng)l件下GPX1的活性;利用免疫熒光雙染技術(shù)研究SBP1與GPX1在各種處理?xiàng)l件下的相互作用。
　　結(jié)果顯示，過氧化氫的處理可以上調(diào)對(duì)照組細(xì)胞中HIF-1α與SBP1的表達(dá)，而在SBP1敲低組，同樣的處理卻并不能上調(diào)細(xì)胞中HIF-1α的表達(dá);GPX1的表達(dá)量在各組別之

10、間無明顯差別，但是其活性在SBP1敲低組中顯著高于對(duì)照組(P＜0.001);免疫熒光提示在過氧化氫處理?xiàng)l件下，SBP1與GPX1均可以形成特殊的核小體(nuclear body)，并且共定位于核中。
　　研究結(jié)果表明，活性氧自由基能夠上調(diào)HIF-1α的表達(dá)，同時(shí)也會(huì)上調(diào)作為HIF-1α靶基因的SBP1的表達(dá)，而利用siRNA敲除SBP1的表達(dá)也會(huì)逆向抑制HIF-1α的表達(dá);另一方面，SBP1雖不能影響GPX1的表達(dá)量，但是能夠通過

11、兩者之間的相互作用顯著抑制GPX1的活性。SBP1的抑癌作用可能是通過它對(duì)GPX1活性的抑制、對(duì)HIF-1α表達(dá)量的上調(diào)，從而調(diào)節(jié)腫瘤氧化還原微環(huán)境(tumor redoxmicroenvironment)而實(shí)現(xiàn)的。
　　第三部分SBP1在肝癌組織中的表達(dá)及其臨床意義研究
　　本部分旨在探討SBP1在肝細(xì)胞癌患者腫瘤組織中的表達(dá)情況以及進(jìn)一步證實(shí)其在體內(nèi)對(duì)GPX1活性的抑制作用，同時(shí)分析SBP1的表達(dá)高低與肝細(xì)胞肝癌臨床病理

12、特征和預(yù)后的關(guān)系。
　　選用新鮮切除的肝癌標(biāo)本19例，其中無血管侵犯9例，有血管侵犯10例，應(yīng)用Western blot技術(shù)驗(yàn)證其中SBP1蛋白表達(dá)情況，比較兩組間SBP1蛋白水平的表達(dá)差異，同時(shí)測定各樣本GPX1的活性。在323例肝細(xì)胞癌組織構(gòu)建的組織芯片中應(yīng)用免疫組化方法檢測SBP1蛋白的表達(dá)，比較分析肝癌組織中SBP1表達(dá)與臨床病理特征以及生存、復(fù)發(fā)的關(guān)系，分析比較肝癌組織中SBP1表達(dá)與術(shù)后腫瘤復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的相關(guān)性，評(píng)估SBP

13、1作為肝癌預(yù)后判斷指標(biāo)的價(jià)值。
　　結(jié)果發(fā)現(xiàn)，無血管侵犯的標(biāo)本中，SBP1的表達(dá)量要顯著高于有血管侵犯的組別(P＜0.05)，同時(shí)標(biāo)本中GPX1的活性與SBP1的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。組織芯片結(jié)果顯示，肝癌組織中SBP1蛋白的表達(dá)水平與年齡、術(shù)前AFP、腫瘤大小、腫瘤數(shù)量、腫瘤包膜、血管侵犯、腫瘤復(fù)發(fā)有關(guān)(P＜0.05)。多因素分析顯示，性別、血清ALB、腫瘤分化程度、腫瘤包膜、腫瘤大小、血管侵犯與SBP1表達(dá)水平為影響患者總體生存率(o

14、verall survival，OS)的獨(dú)立預(yù)后因素;性別、血清ALT、腫瘤包膜、腫瘤大小、血管侵犯與SBP1表達(dá)水平為影響患者復(fù)發(fā)率的獨(dú)立預(yù)后因素。Kaplan-Meier法分析結(jié)果顯示，SBP1低表達(dá)組預(yù)后顯著差于SBP1高表達(dá)組。在SBP1低表達(dá)的病例中，69.08％的患者腫瘤復(fù)發(fā)，其中早期復(fù)發(fā)的病例占到了55.07％;而在SBP1高表達(dá)組中，50.86％的患者腫瘤復(fù)發(fā)，早期復(fù)發(fā)的病例僅占28.45％。利用米蘭標(biāo)準(zhǔn)將患者分層后進(jìn)一

15、步的分析提示，SBP1對(duì)于超出米蘭標(biāo)準(zhǔn)病例的預(yù)后有更大的預(yù)測意義。
　　研究結(jié)果表明，SBP1的低表達(dá)與肝細(xì)胞癌的侵襲、轉(zhuǎn)移及不良預(yù)后相關(guān)。SBP1的表達(dá)是肝癌患者預(yù)后的獨(dú)立預(yù)測指標(biāo)，特別是中晚期的肝癌。
　　結(jié)論
　　1.SBP1在大多數(shù)人肝癌細(xì)胞系中低表達(dá)，尤其是轉(zhuǎn)移潛能較高的細(xì)胞系中;而在正常肝細(xì)胞中高表達(dá)。
　　2.減少SBP1的表達(dá)可以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的遷移，同時(shí)幫助腫瘤細(xì)胞在受到氧自由基攻擊時(shí)保持增殖能力

16、并且逃避凋亡。
　　3.SBP1可以抑制GPX1的活性、上調(diào)HIF-1α的表達(dá)，從而通過調(diào)節(jié)腫瘤氧化還原微環(huán)境來實(shí)現(xiàn)其抑癌作用。
　　4.SBP1的低表達(dá)與肝細(xì)胞癌的侵襲、轉(zhuǎn)移及不良預(yù)后相關(guān)。SBP1的表達(dá)是肝癌患者預(yù)后的獨(dú)立預(yù)測指標(biāo)，特別是在中晚期的肝癌患者中。
　　創(chuàng)新點(diǎn)
　　1.SBP1的促氧化作用可能是其抑制腫瘤的重要機(jī)制。
　　2.首次發(fā)現(xiàn)并報(bào)道SBP1與肝癌預(yù)后密切相關(guān)。肝癌組織中SBP1的表達(dá)