miRNA-21在膽囊癌過表達(dá)通過抑制PTEN促進(jìn)細(xì)胞侵襲與轉(zhuǎn)移的機(jī)制研究.pdf

1、研究背景：
　　膽囊癌（Gallbladder Carcinoma，GBC）是常見的膽道系統(tǒng)腫瘤，早期無特異性的臨床表現(xiàn)，發(fā)現(xiàn)時往往已到臨床中晚期，預(yù)后較差。臨床上GBC確診時，多半已經(jīng)發(fā)生了鄰近器官浸潤和/或通過血液系統(tǒng)發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，很難進(jìn)行根治性手術(shù)，且手術(shù)效果較差，術(shù)后五年生存率不足5%。近年的流行病學(xué)調(diào)查調(diào)查顯示我國大部分地區(qū)GBC發(fā)病率呈明顯上升趨勢。因此，提高GBC患者的遠(yuǎn)期生存率除了要在手術(shù)結(jié)合放化療方面進(jìn)一步規(guī)范和

2、探索外，還應(yīng)該在分子水平上進(jìn)一步研究GBC的發(fā)生、發(fā)展及其侵襲的機(jī)制。通過在分子水平的研究、探索GBC的生物學(xué)行為，尋找特異性生物學(xué)標(biāo)記提高早期診斷率，針對發(fā)病基因進(jìn)行分子靶向治療并在預(yù)后評估等方面進(jìn)行探索。這也是目前GBC分子生物學(xué)研究的重點(diǎn)、熱點(diǎn)方向之一。
　　微小RNA（microRNA, miRNA）是一類內(nèi)源性非編碼短鏈RNA，約22個核苷酸大小，它主要通過與靶mRNA的3’UTR不完全性互補(bǔ)配對抑制mRNA的翻譯，介導(dǎo)

3、轉(zhuǎn)錄后基因調(diào)控。miRNA不僅在細(xì)胞的增殖、分化和凋亡等生物學(xué)功能起到重要的調(diào)控作用，而且和腫瘤的發(fā)生發(fā)展、轉(zhuǎn)移等生物學(xué)效應(yīng)密切相關(guān)。PTEN是迄今為止發(fā)現(xiàn)的第一個具有雙重磷酸酶活性的抑癌基因。PTEN基因編碼的蛋白具有脂質(zhì)磷酸酶和蛋白磷酸酶雙重特異性磷酸酶活性，與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。本課題組發(fā)現(xiàn)在GBC-SD細(xì)胞系中miRNA-21表達(dá)水平與PTEN表達(dá)密切相關(guān)，并進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)證實(shí)在 GBC-SD細(xì)胞系中 PTEN為 miRN

4、A-21靶基因，初步認(rèn)為miRNA-21通過抑制PTEN基因影響了GBC發(fā)生、發(fā)展的可能機(jī)制；同時miRNA-21與細(xì)胞緊密連接蛋白ZO-1和occludin表達(dá)密切相關(guān)，提示miRNA-21可能參與GBC的侵襲與遷移。這為進(jìn)一步研究miRNA-21在GBC生物功能的機(jī)制拓寬了思路。
　　方法：
　　1.在GBC-SD細(xì)胞系沉默microRNA21；
　　1）沉默miRNA-21后分別在mRNA和蛋白水平檢測PTEN、

5、緊密連接相關(guān)蛋白Occludin、ZO-1蛋白表達(dá)水平；
　　2）在GBC-SD細(xì)胞系過表達(dá)/抑制miRNA-21表達(dá)，分別檢測PTEN的蛋白水平和mRNA水平變化；
　　2. Transwell assay檢測GBC-SD細(xì)胞系沉默miRNA-21后細(xì)胞遷移與侵襲能力；
　　3.熒光素酶實(shí)驗(yàn)檢測PTEN與miRNA-21的相互作用機(jī)制；
　　4.收集67例GBC臨床標(biāo)本，原位雜交技術(shù)檢測miRNA-21，免疫組

6、化SP法檢測PTEN、ZO-1和occludin表達(dá)水平；
　　5.采用對 miRNA-21與臨床參數(shù)、PTEN等指標(biāo)進(jìn)行相關(guān)性分析；Kaplan-Meier方法進(jìn)行生存分析，并采用Log-rank檢驗(yàn)比較兩組生存率；采用Cox風(fēng)險比例模型進(jìn)行各個協(xié)變量的聯(lián)合效應(yīng)分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果：
　　1.發(fā)現(xiàn)microRNA21與PTEN、緊密連接蛋白之間的關(guān)系：
　　1）沉默microRNA2

7、1后，PTEN表達(dá)上調(diào)，Occludin、ZO-1蛋白水平升高；
　　2）沉默microRNA21后，發(fā)現(xiàn)Occludin、ZO-1mRNA表達(dá)上升。
　　2.證實(shí) miRNA-21與PTEN在GBC中的表達(dá)負(fù)相關(guān)：
　　1）GBC-SD細(xì)胞中過表達(dá)miRNA-21可下調(diào)PTEN的mRNA和蛋白表達(dá)；
　　2）GBC-SD細(xì)胞中抑制miRNA-21可上調(diào)PTEN的mRNA和蛋白表達(dá)；
　　3）GBC-SD細(xì)

8、胞中抑制miRNA-21后，細(xì)胞遷移與侵襲能力明顯減弱；
　　4）PTEN的3’UTR是miRNA-21的靶序列；
　　5）GBC患者術(shù)后生存結(jié)果分析顯示，miRNA-21表達(dá)與患者預(yù)后呈反比。
　　結(jié)論：
　　1.在GBC-SD細(xì)胞中miRNA21可被沉默；體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)miRNA21基因表達(dá)與PTEN、緊密連接蛋白表達(dá)水平密切相關(guān)；在進(jìn)一步的 GBC-SD細(xì)胞和動物實(shí)驗(yàn)證明沉miRNA21后，GBC侵襲和轉(zhuǎn)移能