二甲雙胍通過(guò)AKT信號(hào)通路抑制食管鱗癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移.pdf

1、背景及目的：
　　二甲雙胍是臨床上廣泛應(yīng)用于治療2型糖尿病的口服降糖藥。近年來(lái)大量流行病學(xué)研究證實(shí)，二甲雙胍可減少2型糖尿病患者的患癌風(fēng)險(xiǎn)。通過(guò)深究其作用機(jī)制，在體外實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)二甲雙胍不僅可通過(guò)抑制多種惡性腫瘤細(xì)胞的增殖、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡來(lái)發(fā)揮其抗腫瘤效應(yīng)，同時(shí)也可抑制它們的侵襲與轉(zhuǎn)移。本課題組前期實(shí)驗(yàn)和不少外文文獻(xiàn)證實(shí)二甲雙胍可在體內(nèi)外誘導(dǎo)食管癌細(xì)胞增殖抑制和促進(jìn)細(xì)胞凋亡；同時(shí)也發(fā)現(xiàn)二甲雙胍對(duì)多種腫瘤細(xì)胞存在抗侵襲、轉(zhuǎn)移的作用。但腫

2、瘤侵襲轉(zhuǎn)移所涉及的分子機(jī)制是極其復(fù)雜的，其中關(guān)于二甲雙胍對(duì)抑制食管癌侵襲轉(zhuǎn)移的作用機(jī)制研究甚少，結(jié)合目前對(duì)二甲雙胍抗腫瘤機(jī)制的研究背景，為進(jìn)一步研究二甲雙胍抑制食管鱗癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制，本研究將探討二甲雙胍是否可通過(guò)AKT依賴的信號(hào)通路，調(diào)控NF-κB和侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白MMP-9、N-cadherin和E-cadherin的表達(dá)情況，從而抑制食管癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移，為臨床上二甲雙胍成為治療食管癌的新型抗腫瘤藥物提供新的理論基礎(chǔ)。

3、r>　　材料和方法：
　　1.用含10％胎牛血清，100U/ml青霉素和100U/ml鏈霉素的DMEM高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)人食管鱗癌細(xì)胞株EC109。
　　2.細(xì)胞接種密度為1×106個(gè)/6cm培養(yǎng)皿中，至培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過(guò)夜后，用含0 mM、5 mM、10 mM、20 mM的二甲雙胍濃度的培養(yǎng)基處理EC109細(xì)胞24h，以無(wú)菌超純水處理細(xì)胞作為對(duì)照組，用transwell和BD Matrigel Invasion Chamber小室

4、分別檢測(cè)二甲雙胍處理對(duì)EC109細(xì)胞的遷移、侵襲的影響。
　　3.細(xì)胞接種密度為1×106個(gè)/6cm培養(yǎng)皿中，至培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過(guò)夜后，用含0 mM、5 mM、10 mM、20 mM的二甲雙胍濃度的培養(yǎng)基處理EC109細(xì)胞24h，以無(wú)菌超純水處理細(xì)胞作為對(duì)照組，用western blot檢測(cè)細(xì)胞總蛋白的p-AKT、AKT、基質(zhì)金屬蛋白MMP-9、N-cadherin and E-cadherin，和核蛋白NF-κB的表達(dá)情況。

5、　　4.細(xì)胞接種密度為1×106個(gè)/6cm培養(yǎng)皿中，至培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過(guò)夜后，用含20 mM濃度二甲雙胍的培養(yǎng)基處理EC109細(xì)胞24h后，加或不加入終濃度為100 nM的胰島素（AKT激活劑）處理20min。另外設(shè)置含終濃度為10μM的LY294002（PI3K抑制劑）實(shí)驗(yàn)組，含終濃度為100nM的胰島素實(shí)驗(yàn)組，分別處理EC109細(xì)胞24h和20min，以無(wú)菌超純水處理細(xì)胞為對(duì)照組，以DMSO處理細(xì)胞為溶劑組，用transwell和BD

6、Matrigel Invasion Chamber小室分別檢測(cè)二甲雙胍、LY294002、胰島素等對(duì)EC109細(xì)胞的遷移、侵襲的影響。
　　5.細(xì)胞接種密度為1×106個(gè)/6cm培養(yǎng)皿中，至培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過(guò)夜后，用含20mM濃度二甲雙胍的培養(yǎng)基處理EC109細(xì)胞24h后，加或不加入終濃度為100nM的胰島素（AKT激活劑）處理20min。另外設(shè)置含終濃度為10μM的LY294002（PI3K/AKT抑制劑）實(shí)驗(yàn)組，含終濃度為100n

7、M的胰島素實(shí)驗(yàn)組，分別處理EC109細(xì)胞24h和20min，以無(wú)菌超純水處理細(xì)胞為對(duì)照組，以DMSO處理細(xì)胞為溶劑組，用western blot檢測(cè)細(xì)胞總蛋白的p-AKT、AKT、MMP-9、N-cadherin、E-cadherin，和核蛋白NF-κB的表達(dá)情況。
　　6.實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析和處理：用Graph Pad Prism5.0軟件，所有數(shù)據(jù)均使用單因素方差分析的Tukey’s檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，每組進(jìn)行3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)。 P<0

8、.05和P<0.01有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果：
　　1.二甲雙胍可抑制EC109細(xì)胞的遷移和轉(zhuǎn)移能力。
　　2.二甲雙胍可抑制EC109細(xì)胞的AKT的磷酸化。
　　3.二甲雙胍可抑制EC109細(xì)胞的NF-κB， MMP-9、N-cadherin的蛋白表達(dá)，促進(jìn)E-cadherin的表達(dá)。
　　4.胰島素（AKT激活劑）減弱了二甲雙胍抗EC109細(xì)胞遷移、侵襲的能力。
　　5.胰島素減弱了二甲雙胍對(duì)食管