破傷風(fēng)毒素C片段單克隆抗體的研制與鑒定.pdf

1、破傷風(fēng)毒素是由破傷風(fēng)梭菌在厭氧環(huán)境中產(chǎn)生的強(qiáng)烈的神經(jīng)毒素，是已知最毒的毒素之一。根據(jù)破傷風(fēng)毒素在體內(nèi)的作用，將其分為A、B、C三個(gè)部分。破傷風(fēng)毒素C片段(TetC)不具備神經(jīng)毒性，卻保留了完整毒素與神經(jīng)節(jié)苷脂結(jié)合等許多性質(zhì)，免疫效果與毒素相當(dāng)，是毒素的保護(hù)性抗原，用TetC蛋白誘導(dǎo)產(chǎn)生的單克隆抗體(McAb)具有中和毒素的能力。TetC與神經(jīng)元表面的結(jié)合是破傷風(fēng)毒素其它片段發(fā)揮毒性作用的先決條件。本研究構(gòu)建了原核表達(dá)TetC蛋白的重組大

2、腸桿菌，獲得具有抗原活性的融合蛋白，并制備了特異性針對TetC的McAbs，這為研究TetC的生物學(xué)功能、破傷風(fēng)毒素結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系提供重要條件，同時(shí)也為建立快速檢測破傷風(fēng)抗毒素水平的方法提供了生物材料。 一、破傷風(fēng)毒素C片段基因的克隆及其在大腸桿菌中的表達(dá)根據(jù)破傷風(fēng)梭菌64008菌株基因組DNA序列設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增TetC基因，并將其定向克隆至原核表達(dá)載體pGEX-6p-1，構(gòu)建出重組菌BL21(pGEX-6p-1-TetC)，經(jīng)

3、IPTG(1mM終濃度)誘導(dǎo)表達(dá)，利用 Redipack GST purification module進(jìn)行親和層析獲得純化的表達(dá)產(chǎn)物。SDS-PAGE結(jié)果表明表達(dá)的融合蛋白GST-TetC大小與預(yù)期一致。Western-blot檢測結(jié)果顯示融合蛋白GST-TetC可以與破傷風(fēng)類毒素抗血清發(fā)生特異性結(jié)合反應(yīng)，說明其具有良好的免疫原性。 二、破傷風(fēng)毒素C片段單克隆抗體的制備及鑒定應(yīng)用淋巴細(xì)胞雜交瘤技術(shù)，以重組菌Rosetta(DE

4、3)(pET-TetC)表達(dá)產(chǎn)物His-TetC蛋白免疫8w雌性BALB/c小鼠，100μg/只。首免時(shí)，抗原與等量弗氏完全佐劑(FCA)乳化，皮下分點(diǎn)注射。間隔2w，用弗氏不完全佐劑(FIA)乳化抗原，腹腔注射進(jìn)行第二次免疫。此后每隔2w用弗氏不完全佐劑乳化抗原腹腔注射一次，直至ELISA檢測血清抗體效價(jià)達(dá)到1:10000以上，尾靜脈注射等量的不加佐劑的抗原作為加強(qiáng)免疫。3d后，取免疫小鼠脾細(xì)胞和骨髓瘤Sp2/0-Ag-14細(xì)胞進(jìn)行融

5、合。以純化蛋白GST-TetC作為檢測抗原，用間接ELISA方法篩選陽性克隆，獲得5株穩(wěn)定分泌TetC單克隆抗體的細(xì)胞株，分別命名為1E5、5G10、689、7D6、7F5，亞類鑒定結(jié)果都為IgG<,1>，腹水測定效價(jià)除1E5為3×2<'10>外，其余均為1×10<'5>。Western-blot試驗(yàn)顯示5株McAbs均能與融合蛋白His-TetC發(fā)生反應(yīng)，出現(xiàn)特異性條帶，而與作為對照的空載體細(xì)菌Rosetta(DE3)(pET)和BL