抑制素A的克隆表達(dá)以及單克隆抗體的制備與鑒定.pdf

1、抑制素A是一種(32kDa)大分子糖蛋白肽類激素，由α及β兩個(gè)亞基以二硫鍵(-S-S)偶聯(lián)構(gòu)成，屬于轉(zhuǎn)化生長因子β(TGF2β)[1，5，6]多肽家族。其基本作用是抑制垂體產(chǎn)生卵泡刺激素(FSH)[4-5]，卵泡抑制素也在性腺中通過自分泌和旁分泌的形式調(diào)節(jié)卵泡細(xì)胞的分化和甾體的生成；大多數(shù)循環(huán)抑制素由性腺產(chǎn)生，另外它們?cè)谠S多性腺外的組織，包擴(kuò)腦，腎上腺，骨髓，胎盤都有表達(dá)并且在局部都有一定的調(diào)節(jié)作用[2-3]。抑制素A不僅與卵泡發(fā)育[7

2、-9]和卵巢腫瘤[10-12]有關(guān)而且近年來還發(fā)現(xiàn)它可以作為孕中期唐氏綜合癥篩查的一項(xiàng)指標(biāo)[13-16]。
　　 唐氏綜合癥(Down’s)是人類最早發(fā)現(xiàn)且最常見的常染色體病，也是造成兒童先天性智力低下的重要原因之一[17，21]。唐氏無明顯的家族史[22]，每個(gè)孕婦都有生出該患兒的可能性，至今尚無有效的治療手段，所以產(chǎn)前診斷就顯得較為重要，目前開展的羊水穿刺及絨毛活檢僅限于高危人群[19]，僅能檢出20％的唐氏患兒，此外羊水穿

3、刺及絨毛活檢均為侵入性檢查，不適于群體檢查，為了能最大限度減少產(chǎn)前有創(chuàng)檢查降低唐氏患兒的的出生率，產(chǎn)前的血清學(xué)的篩查已被廣泛用于臨床?，F(xiàn)在妊娠中期的血清學(xué)檢測主要采取AFP+HCG+UE3的三聯(lián)實(shí)驗(yàn)[17，19]，但是這些標(biāo)志物的血清水平在正常和非正常人群都有所重疊，所以，新的標(biāo)志物的發(fā)現(xiàn)和應(yīng)用綜合的檢測方案是提高檢出率的有效的方法。自從發(fā)現(xiàn)抑制素A的血清水平在懷有唐氏患兒的孕婦的血清中的水平高于正常妊娠后，抑制素A已被作為檢測唐氏綜合

4、癥的一個(gè)有效的標(biāo)志物。
　　 Down’s綜合征妊娠中母血標(biāo)記物濃度變化機(jī)制尚不清楚，但胎兒產(chǎn)物或胎兒胎盤產(chǎn)物(AFP，uE3)減少，而胎盤產(chǎn)物(HCG，DIA)增加，證實(shí)了母體血漿中抑制素A等成分主要來自胎盤而不是胎兒[23]。抑制素A作為Down’s綜合征孕中期血清篩查的第4個(gè)標(biāo)記物，在妊娠時(shí)，抑制素A主要由胎盤分泌并且有活性的二聚體的形式(DIA)在血液中的水平明顯升高。妊娠前三個(gè)月中DIA的血清水平升高隨后大約在第10周

5、下降，在第15-25周期間產(chǎn)婦的血清中的水平保持一個(gè)穩(wěn)定的水平一直持續(xù)到妊娠末期達(dá)到峰值[15]。它的這種穩(wěn)定分泌周期使DIA的檢測更加優(yōu)化于其它的一些產(chǎn)前診斷指標(biāo)。自從檢測到在懷有唐氏綜合癥的產(chǎn)婦血清中抑制素A的水平高于正常孕婦的兩倍或更高[24]，DIA已經(jīng)和其他產(chǎn)前診斷的標(biāo)志物都作了比較和對(duì)照，發(fā)現(xiàn)在妊娠的中期聯(lián)合AFP+HCG+UE3，可以將檢出率提高八個(gè)百分點(diǎn)達(dá)到84％，并且假陽性率只有5％。另外HCG在妊娠15-20周含量變

6、化較大而相對(duì)的DIA的水平卻相對(duì)穩(wěn)定，所以有許多學(xué)者認(rèn)為DIA的檢測可能更優(yōu)于HCG。我們都知道妊齡多是根據(jù)末次月經(jīng)所得。但是這樣所得的結(jié)果可能存在誤差，和其他血清標(biāo)志物相比較，DIA的水平在妊娠的第二和第三個(gè)月不會(huì)隨著妊齡的變化而有很大的波動(dòng)，這在研究更可靠的數(shù)據(jù)去評(píng)價(jià)唐氏綜合癥時(shí)，它有很大的優(yōu)勢(shì)去解釋這些結(jié)果，并且不會(huì)被不正確的妊齡所影響[15]。
　　 隨著現(xiàn)在人們對(duì)唐氏綜合癥的危害的了解，大家都希望能在沒有危險(xiǎn)的情況下進(jìn)

7、行早期診斷，早期終止妊娠。所以，又有實(shí)驗(yàn)室用DIA聯(lián)合NT，PAPP-A，β-HCG進(jìn)行了篩查，當(dāng)結(jié)合年齡若加上DIA則可以使早期診斷率提高到90％。
　　 早期抑制素A的測定在檢測DIA和α亞單位的游離形式之間存在一定困難，因此在檢測結(jié)果中出現(xiàn)了許多不確定的值[25]，但是隨著針對(duì)DIA的特異性抗體的出現(xiàn)使得DIA的檢測不在是難事?，F(xiàn)在唯一能測定抑制素A皮克水平的方法仍是免疫測定法[26]。這種方法都已被證實(shí)可以用來特異性的檢

8、測人類血漿中DIA的水平，這種方法都是雙夾心酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)[26，27]隨著這些檢測技術(shù)的發(fā)展，使得各個(gè)實(shí)驗(yàn)室的篩查結(jié)果也有了很大的差異，有報(bào)道說在比較懷有唐氏的孕婦和正常的孕婦抑制素A的水平時(shí)發(fā)現(xiàn)在7-8周時(shí)其水平降低而在9-11周時(shí)升高。這些差異除了實(shí)驗(yàn)時(shí)的差異外[28-30]，抑制素A的檢測方法的準(zhǔn)確性現(xiàn)在還沒有一個(gè)真正的金標(biāo)準(zhǔn)，并且在從組織中提取的和重組體的純化都存在一定的不均一性，所以還需要有更特異，更敏感的檢測方法并且使檢

9、測的指標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)化。另外，我國用于檢測抑制素A的ELISA試劑盒也仍多是引進(jìn)國外的進(jìn)口產(chǎn)品，但是這樣就大大增加了檢測成本，阻礙了其在臨床的普遍應(yīng)用，而且在前期工作中我們已經(jīng)研制出了AFP、HCG、UE3三種檢測試劑盒，所以我們也希望能夠研制出特異性強(qiáng)的國產(chǎn)化的檢測試劑盒以便和上面三種指標(biāo)聯(lián)合應(yīng)用，更好的推動(dòng)唐氏綜合癥的臨床檢測。
　　 為此，本課題擬通過制備抗抑制素A的單克隆抗體，為進(jìn)一步的唐氏綜合癥的篩查打下基礎(chǔ)，進(jìn)一步去評(píng)價(jià)抑制

10、素A與在唐氏綜合癥診斷中的差異及價(jià)值，了解檢測血清抑制素A是否在敏感性和特異性上優(yōu)于其他的標(biāo)志物[28]。探討其在唐氏綜合癥診斷中的可靠性和可行性。
　　 因?yàn)橐种扑谹在循環(huán)中不僅以二聚體的活性形式存在而且還會(huì)有許多未知功能的小分子形式[26]，這就使得我們想找到一個(gè)能夠針對(duì)它的更有特異性的檢測方法。
　　 蛋白質(zhì)的免疫原性主要是通過表位體現(xiàn)的，準(zhǔn)確預(yù)測B細(xì)胞表位不僅有助于基礎(chǔ)免疫學(xué)研究，也有助于疫苗和抗體的研究開發(fā)，有

11、助于疾病的治療與診斷。
　　 本研究一方面從胎盤中分別成功擴(kuò)增并克隆出抑制素A的亞基α(INHA)的基因全長片段和其去信號(hào)肽的片段，將所得的目的基因分別克隆至pET-32a表達(dá)載體，發(fā)現(xiàn)只有其去信號(hào)肽的片段在大腸桿菌中有大量不可溶性表達(dá)。用親和層析法純化重組蛋白。INHA蛋白通過抗His的抗體鑒定后免疫小鼠制備多克隆抗體。分別用ELISA、Western-blot法檢測和鑒定多克隆抗體。另一方面，本研究從抑制素A兩個(gè)亞基的氨基酸

12、序列入手用ExPASy，SignalP等軟件分析該基因(GenBank號(hào)：NM002191；NM002192)編碼蛋白綜合分析預(yù)測INHA和INHBA的B細(xì)胞抗原位點(diǎn)，然后把氨基酸序列提交到NCBI中進(jìn)行同源性比對(duì)，綜合分別分析選取四條抗原表位并以固相合成法合成抗原。把純化后的抗原連接大分子的蛋白后免疫小鼠制備多克隆和單克隆抗體。分別用ELISA、Western-blot法檢測和鑒定抗體。
　　 結(jié)果顯示，利用RT-PCR技術(shù)成

13、功克隆了INHA的基因全長片段(INHA)和其去信號(hào)肽的片段(INHA1)，經(jīng)測序并與GenBank中序列進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果完全一致，大小分別為1101bp和1054bp。并且將INHA和INHA1基因分別克隆到pET-32a原核表達(dá)質(zhì)粒，經(jīng)PCR、限制性酶切分析和測序等鑒定，成功構(gòu)建了pET32a-A和pET32a-A1重組質(zhì)粒。
　　 重組質(zhì)粒pET32a-A1在大腸桿菌中表達(dá)出INHA1融合蛋白，表達(dá)產(chǎn)物均主要以不可溶性形式存

14、在。重組蛋白分子量約為58kDa與理論值基本符合。表達(dá)量分別約占菌體總蛋白的20％，重組蛋白經(jīng)過純化后，純度均達(dá)80％。用抗His的抗體對(duì)表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行Western-blot分析，發(fā)現(xiàn)特異性區(qū)帶出現(xiàn)在58kDa處，表明該蛋白確實(shí)是所要表達(dá)的融合蛋白。進(jìn)一步用純化的表達(dá)產(chǎn)物免疫小鼠制備免疫血清，ELISA分析表明重組蛋白能與該免疫血清起反應(yīng)，而與正常小鼠血清不發(fā)生交叉反應(yīng)，Western-blot分析，發(fā)現(xiàn)可與胎盤中的天然蛋白反應(yīng)，說明重

15、組蛋白具有抗原活性。
　　 用純化的表達(dá)產(chǎn)物INHA1以及免疫小鼠制備多克隆抗體，然后將抗多肽抗體與INHA1抗原以及多肽片段與抗INHA1的抗體進(jìn)行反應(yīng)，進(jìn)一步篩選了一個(gè)優(yōu)勢(shì)的抗原表位并分別制備了24株單克隆抗體。其中五株單抗細(xì)胞株培養(yǎng)上清的效價(jià)用ELISA法檢測，OD值可達(dá)到1:128到1:512之間。Western-blot結(jié)果顯示：可與胎盤中的天然蛋白發(fā)生特異性反應(yīng)，而對(duì)照組則無明顯條帶出現(xiàn)。說明制備的單抗均為特異性單抗