RbAp48在HPV致宮頸癌中的功能研究.pdf

1、宮頸癌是女性生殖系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤，在世界范圍內(nèi)發(fā)病率僅次于乳腺癌居第二位，大量的研究資料表明人乳頭瘤病毒(Human papillomavirus，HPV)感染是誘發(fā)宮頸癌的首要啟動因素，因此，加強(qiáng)HPV致宮頸癌機(jī)制的研究是有效防治宮頸癌的前提。 人乳頭瘤病毒是雙鏈DNA病毒，具有嗜上皮特性，能夠感染皮膚與粘膜的上皮組織并形成增生性疾病。高危型HPV(HPV16、18、33型等)與宮頸癌等惡性腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)，低危型HPV

2、(HPV 6、11型)可導(dǎo)致尖銳濕疣等良性病變。本研究運(yùn)用基于固體pH梯度等電聚焦雙向電泳(Two-dimensional gel electrophoresis；2-DE)、肽質(zhì)量指紋圖譜鑒定技術(shù)(Peptide Mass spectrometry analysis)和生物信息學(xué)(Bioinformatics)等蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)體系，鑒定了HPV16轉(zhuǎn)化的人宮頸上皮永生化細(xì)胞系H8和人宮頸癌細(xì)胞系Caski的差異蛋白，RbAp48作為其

3、中與腫瘤發(fā)生密切相關(guān)的差異表達(dá)蛋白質(zhì)，引起了作者極大的興趣并以此為研究目標(biāo)展開了深入的功能研究。RbAP48，作為一種Rb (retinoblastoma-binding protein)結(jié)合蛋白，是從涉及不同染色質(zhì)集合、裝配以及核小體修飾復(fù)合物，包括組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶(histonedeacetylase；HDAC)分離出的復(fù)合物中第一個被鑒定的高豐度蛋白。 本研究在國內(nèi)外第一次系統(tǒng)全面的揭示了RbAP48與宮頸癌發(fā)生的密切關(guān)系

4、，體內(nèi)細(xì)胞水平和體外動物實(shí)驗(yàn)研究表明RbAP48是調(diào)控宮頸癌發(fā)病過程HPV轉(zhuǎn)化活性的至關(guān)重要的分子，為全面深刻的認(rèn)識HPV致癌機(jī)理從而更好的預(yù)防防治奠定基礎(chǔ)。 一、RbAp48在宮頸癌中的低表達(dá) 利用雙向電泳技術(shù)對正常永生化細(xì)胞H8及宮頸癌細(xì)胞Caski總蛋白的分離，并通過蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)分析，成功鑒定出20個表達(dá)有差異的蛋白質(zhì)。其中RbAp48作為一個在腫瘤細(xì)胞中低表達(dá)的蛋白引起作者極大的興趣。首先運(yùn)用real-time

5、 PCR及western blot技術(shù)分別從RNA和蛋白水平上驗(yàn)證了其表達(dá)在H8中明顯高于在Caski中的表達(dá)，然后又利用其他宮頸癌細(xì)胞系如SiHa、HeLa以及宮頸角質(zhì)細(xì)胞HCK上也證實(shí)了RbAp48的表達(dá)在宮頸癌細(xì)胞中的普遍性。同時搜集臨床上其他腫瘤組織如乳腺癌、卵巢癌、胃癌等相關(guān)的腫瘤及正常組織，試圖發(fā)現(xiàn)RbAp48的表達(dá)在這些腫瘤中是否也有差異。Western blot分析顯示在這些腫瘤組織中，RbAp48的表達(dá)沒有明顯差別，這

6、證實(shí)了RbAp48的低表達(dá)在宮頸癌中的特異性。 二、RbAp48的表達(dá)變化可以影響細(xì)胞的增殖分化及體外腫瘤形成 利用RNAi(RNA干擾技術(shù))構(gòu)建能有效降低細(xì)胞內(nèi)源性RbAp48表達(dá)的質(zhì)粒pSUPER-RbAp48，將其轉(zhuǎn)入H8建立穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞系H8+siRbAp48，同時將pSUPER空載體轉(zhuǎn)染H8細(xì)胞作為對照組建立穩(wěn)定細(xì)胞系。通過比較分析兩種穩(wěn)定細(xì)胞系的增殖分化等的差異，可以明顯觀察到轉(zhuǎn)染pSUPER-RbAp48

7、的H8細(xì)胞能夠增加增殖細(xì)胞線粒體能量代謝過程中乳酸脫氫酶的釋放，從而促進(jìn)細(xì)胞能量代謝：能夠促進(jìn)細(xì)胞分裂增殖，細(xì)胞數(shù)目增加；增加細(xì)胞軟瓊脂克隆生長的數(shù)量；同時明顯降低反映細(xì)胞衰老死亡指標(biāo)的β-細(xì)胞半乳糖苷酶的活性。這些實(shí)驗(yàn)都表明降低細(xì)胞內(nèi)源性的RbAp48的表達(dá)可以明顯促進(jìn)體外細(xì)胞水平的增殖分化并抑制細(xì)胞的死亡衰老。 將穩(wěn)定轉(zhuǎn)染pSUPER-RbAp48和pSUPER空載體的細(xì)胞分別皮下注射裸鼠，四周后裸鼠體內(nèi)腫瘤形成的情況表明，

8、由于RbAp48本身并不具備致瘤性，因此轉(zhuǎn)染pSUPER空載體的細(xì)胞注射的裸鼠體內(nèi)沒有腫瘤形成；而穩(wěn)定轉(zhuǎn)染pSUPER-RbAp48細(xì)胞注射的6只裸鼠中有5只體內(nèi)均長出腫瘤。 為了進(jìn)一步研究RbAp48在腫瘤形成過程中的功能，從另一方面增加RbAp48的表達(dá)，觀察RbAp48的過表達(dá)對體內(nèi)體外腫瘤發(fā)生的影響。分別轉(zhuǎn)染了RbAp48的表達(dá)質(zhì)粒及pcDNA 3.1到Caski細(xì)胞中建立穩(wěn)定細(xì)胞系，進(jìn)行細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)分析。MTT分析、細(xì)

9、胞生長曲線、以及軟瓊脂克隆形成試驗(yàn)均表明過表達(dá)RbAp48明顯降低細(xì)胞的生長率，β-細(xì)胞半乳糖苷酶分析顯示細(xì)胞衰老率增加。體外裸鼠腫瘤形成試驗(yàn)表明在宮頸癌細(xì)胞Caski中增加RbAp48的表達(dá)后，細(xì)胞的致瘤性明顯降低，裸鼠體內(nèi)形成的腫瘤明顯縮小。 這些都表明RbAp48作為一種新發(fā)現(xiàn)的調(diào)控人乳頭瘤病毒HPVl6陽性的宮頸癌轉(zhuǎn)化活性的重要蛋白，能夠抑制腫瘤細(xì)胞的生長，降低其致瘤性，結(jié)合最近研究報道RbAp48作為一種腫瘤放射敏感性

10、蛋白，提示RbAp48可以作為一種HPV相關(guān)疾病的治療靶位用于臨床應(yīng)用，為宮頸癌的預(yù)防和治療提供一種新的方向和理論依據(jù)。 三、RbAp48通過調(diào)節(jié)其他癌基因和抑癌基因的表達(dá)來影響腫瘤的發(fā)生 為了進(jìn)一步探討RbAp48影響宮頸癌的機(jī)制，分別研究了其對腫瘤癌基因HPVE6、E7，c-myc，抑癌基因Rb，P53，以及Rb/E2F靶位基因的表達(dá)影響。 通過將RbAp48利用siRNA干擾之后，發(fā)現(xiàn)HPVE6、E7以及c

11、-myc基因的表達(dá)均上升，而抑癌基因Rb和p53的表達(dá)則明顯下降。另外本文還檢查了Rb/E2F 靶位基因的表達(dá)情況包括Cyclin A，Cyclin E，Cyclin D1，proliferating cell nuclear antigen(f)CNA)和p16INK4a，結(jié)果發(fā)現(xiàn)只有Cyclin D1的表達(dá)有所升高，也許是因?yàn)镽bAp48通過影響Cyclin D1的表達(dá)來影響宮頸癌的分化。 四、ECM1在軟骨發(fā)育中抑制軟骨發(fā)

12、育的作用 本文通過酵母雙雜交試驗(yàn)在研究COMP(Cartilage oligomericmatrix protein，軟骨寡聚基質(zhì)蛋白)蛋白這一基質(zhì)蛋白在軟骨發(fā)育中的作用時，用COMP蛋白的EGF片段做誘餌，篩選出來了ECM1(extracellular matrixprotein 1，細(xì)胞外基質(zhì)蛋白1)這一細(xì)胞外基質(zhì)蛋白。通過研究其與COMP的相互作用，明確了二者在體內(nèi)外相互結(jié)合作用的模式，并發(fā)現(xiàn)ECM1具有抑制軟骨發(fā)育的作用