下調(diào)RbAp48表達(dá)抑制人消化道腫瘤細(xì)胞的增殖.pdf

1、研究背景:
　　消化道腫瘤是最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一。食管癌、大腸癌、胃癌等的發(fā)病率和死亡率一直位居各種癌癥的前列。當(dāng)前對(duì)消化道腫瘤的治療主要采用手術(shù)、放療以及化療，但是放、化療的毒副作用明顯，且效果并不令人滿意。因此，尋找新的藥物治療靶點(diǎn)顯得尤為重要。
　　本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)下調(diào)RbAp48基因表達(dá)能抑制肺癌細(xì)胞生長(zhǎng)并逆轉(zhuǎn)其順鉑耐藥性。由此本研究設(shè)想:下調(diào)RbAp48表達(dá)也可能對(duì)消化道腫瘤的生長(zhǎng)繁殖存在抑制作用;RbAp48

2、可能是治療消化道腫瘤的一個(gè)潛在靶點(diǎn)，為此我們進(jìn)行了相關(guān)的研究。.
　　第一部分下調(diào)RbAp48表達(dá)對(duì)人食管癌細(xì)胞增殖作用的研究
　　目的:研究下調(diào)RbAp48表達(dá)對(duì)人食管癌細(xì)胞增殖的作用，探索RbAp48作為食管癌治療靶點(diǎn)的可能性。方法:1、免疫組化檢測(cè)RbAp48在食管癌組織及其癌旁組織中的表達(dá)。2、Western blot法檢測(cè)siRNA干擾RbAp48表達(dá)效果。3、RbAp48-siRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞后:①M(fèi)TT法檢測(cè)人食

3、管癌細(xì)胞EC109、人正常上皮細(xì)胞L132生長(zhǎng)情況。②平板克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)EC109細(xì)胞克隆形成能力變化。③MTT檢測(cè)EC109、EC109/DDP細(xì)胞對(duì)順鉑敏感性變化。4、體內(nèi)實(shí)驗(yàn):BABL/C裸鼠皮下接種EC109成瘤后，瘤內(nèi)注射RbAp48-siRNA，比較腫瘤生長(zhǎng)差異。5、①β-半乳糖酐酶染色法檢測(cè)細(xì)胞衰老情況。②流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期變化及細(xì)胞凋亡。結(jié)果:1、RbAp48在食管癌組織中表達(dá)明顯高于其癌旁組織中的表達(dá)。2、RbA

4、p48-siRNA能有效下調(diào)EC109細(xì)胞株中RbAp48的表達(dá)。3、RbAp48-siRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞后:①陰性對(duì)照組與RbAp48-siRNA組EC109細(xì)胞的抑制率分別為:(18.54±2.80)％、(45.24±2.74)％(p＜0.01)，RbAp48-siRNA組抑制率明顯升高，而正常上皮細(xì)胞株L132細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率無(wú)顯著變化(p＞0.05）;②空白組、陰性對(duì)照組、RbAp48-siRNA組克隆形成數(shù)分別為165.00±13.

5、00、161.00±11.53和101.00±3.61，RbAp48-siRNA組克隆形成數(shù)明顯減少(p＜0.01)。③順鉑對(duì)EC109空白組、陰性對(duì)照組和RbAp48-siRNA組細(xì)胞的IC50值分別為4.76±0.09μmol/L、2.87±0.14μmol/L、0.89±0.02μmol/L(p＜0.01)，順鉑對(duì)食管癌耐藥株細(xì)胞EC109/DDP空白組、陰性對(duì)照組和RbAp48-siRNA組細(xì)胞的IC50值分別為25.69±0.

6、69μmol/L、15.58±0.36μmol/L、8.26±0.96μmol/L(p＜0.01)，兩種細(xì)胞對(duì)順鉑敏感性均顯著增加。4、體內(nèi)實(shí)驗(yàn):與空白組相比，腫瘤重量由997.10±141.50mg下降為202.50±81.34 mg(p＜0.01)，腫瘤體積由1627.00±261.90mm3下降為371.40±155.90 mm3(p＜0.01)。5、①與空白組、陰性對(duì)照組相比，RbAp48-siRNA組細(xì)胞出現(xiàn)明顯的衰老現(xiàn)象。②

7、與空白組、陰性對(duì)照組相比，RbAp48-siRNA組細(xì)胞發(fā)生明顯G2/M期阻滯:轉(zhuǎn)染后第三天G2/M期細(xì)胞比例分別由(13.35±2.84)％、(16.97±2.64)％上升為(31.48±11.39)％(p＜0.01)。③與空白組、陰性對(duì)照組相比，RbAp48-siRNA組轉(zhuǎn)染后第四天細(xì)胞凋亡率由(5.44±1.36)％、(7.25±0.44)％上升為(12.18±0.50)％(p＜0.01)。結(jié)論:1、RbAp48在食管癌組織中表達(dá)

8、明顯高于其癌旁組織。2、下調(diào)RbAp48表達(dá)能阻滯食管癌細(xì)胞周期，誘導(dǎo)細(xì)胞衰老、凋亡，抑制細(xì)胞增殖，對(duì)正常細(xì)胞沒(méi)有明顯作用。3、下調(diào)RbAp48表達(dá)，能顯著提高食管癌細(xì)胞及其耐藥細(xì)胞株對(duì)順鉑的敏感性。4、RbAp48有望成為治療食管癌的新靶點(diǎn)。
　　第二部分下調(diào)RbAp48表達(dá)對(duì)人大腸癌細(xì)胞增殖作用的研究
　　目的:研究下調(diào)RbAp48表達(dá)對(duì)人大腸癌細(xì)胞增殖的作用，探索RbAp48作為大腸癌治療靶點(diǎn)的可能性。方法:1、免疫組

9、化檢測(cè)RbAp48在大腸癌組織及其癌旁組織中的表達(dá)。2、Western blot法檢測(cè)siRNA干擾RbAp48表達(dá)效果。3、RbAp48-siRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞后:①M(fèi)TT法檢測(cè)人大腸癌細(xì)胞HT-29、人正常上皮細(xì)胞L132生長(zhǎng)情況。②平板克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)HT-29細(xì)胞克隆形成能力變化。③MTT法檢測(cè)HT-29細(xì)胞對(duì)5-FU敏感性變化。4、體內(nèi)實(shí)驗(yàn):BABL/C裸鼠皮下接種HT-29成瘤后，瘤內(nèi)注射RbAp48-siRNA，比較腫瘤生長(zhǎng)差

10、異。5、①β-半乳糖酐酶染色法檢測(cè)細(xì)胞衰老情況。②流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期的變化及細(xì)胞凋亡。結(jié)果:1、RbAp48在大腸癌組織中表達(dá)明顯高于其癌旁組織。2、RbAp48-siRNA能有效下調(diào)HT-29中RbAp48的表達(dá)。3、RbAp48-siRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞后:①陰性對(duì)照組與RbAp48-siRNA組抑制率分別為:(5.08±1.24)％、(33.69±6.30)％(p＜0.01)，RbAp48-siRNA組抑制率明顯升高，而正常上皮細(xì)胞

11、株L132細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率無(wú)顯著變化(p＞0.05)。②空白組、陰性對(duì)照組、RbAp48-siRNA組克隆形成數(shù)分別為組108.70±4.67、103.00±2.08和68.00±4.62，RbAp48-siRNA組克隆形成數(shù)明顯減少(p＜0.01)。③5-FU對(duì)HT-29空白組、陰性對(duì)照組和RbAp48-siRNA組細(xì)胞的IC50值分別為94.89±6.97μmol/L、57.42±2.74μmol/L和17.80±0.42μmol/L

12、(p＜0.01)，細(xì)胞對(duì)5-FU敏感性均顯著增加。4、體內(nèi)實(shí)驗(yàn):與空白組相比，腫瘤重量由210.2±93.04 mg下降為90.44±59.87 mg(p＜0.05)，腫瘤體積由377.20±193.40mm3下降為141.80±79.35mm3(p＜0.05)。5、①與空白組、陰性對(duì)照組相比，RbAp48-siRNA組細(xì)胞出現(xiàn)明顯的衰老現(xiàn)象。②RbAp48-siRNA轉(zhuǎn)染HT-29細(xì)胞后未發(fā)生明顯細(xì)胞周期阻滯也未發(fā)生明顯細(xì)胞凋亡。結(jié)論

13、:1、RbAp48在大腸癌組織中表達(dá)明顯高于其癌旁組織。2、下調(diào)RbAp48表達(dá)能誘導(dǎo)細(xì)胞衰老，抑制細(xì)胞增殖，對(duì)正常細(xì)胞沒(méi)有明顯作用。3、下調(diào)RbAp48表達(dá)能顯著提高大腸癌細(xì)胞對(duì)5-FU的敏感性。4、RbAp48有望成為治療大腸癌的新靶點(diǎn)。
　　第三部分下調(diào)RbAp48表達(dá)對(duì)人胃癌細(xì)胞增殖作用的研究
　　目的:研究下調(diào)RbAp48表達(dá)對(duì)人胃癌細(xì)胞增殖的作用，探索RbAp48作為胃癌治療靶點(diǎn)的可能性。方法:1、免疫組化檢測(cè)R

14、bAp48在胃癌組織及其癌旁組織中的表達(dá)。2、Western blot法檢測(cè)siRNA干擾RbAp48表達(dá)效果。3、RbAp48-siRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞后:①M(fèi)TT法檢測(cè)人胃癌細(xì)胞HGC-27、人正常上皮細(xì)胞L132細(xì)胞生長(zhǎng)情況。②平板克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)克隆形成能力。③MTT檢測(cè)HGC-27細(xì)胞對(duì)5-FU敏感性變化。4、①β-半乳糖酐酶染色法檢測(cè)細(xì)胞衰老情況。②流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期的變化及細(xì)胞凋亡。結(jié)果:1、RbAp48在胃癌組織中表達(dá)明顯

15、高于在胃癌旁組織中的表達(dá)。2、RbAp48-siRNA能有效下調(diào)HGC-27中RbAp48的表達(dá)。3、RbAp48-siRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞后:①陰性對(duì)照組與RbAp48-siRNA組抑制率分別為:(35.00±2.04)％、(70.39±1.21)％(p＜0.01)，RbAp48-siRNA組抑制率明顯升高，而正常上皮細(xì)胞株L132細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率無(wú)顯著變化(p＞0.05)。②空白組、陰性對(duì)照組、RbAp48-siRNA組克隆形成數(shù)分別為組1

16、11.30±8.62、31.33±2.19和4.00±1.73，RbAp48-siRNA組克隆形成數(shù)明顯減少(p＜0.01)。③5-FU對(duì)HGC-27空白組、陰性對(duì)照組和RbAp48-siRNA組細(xì)胞的IC50值分別為3.42±0.39μmol/L、1.84±0.04μmol/L和0.07±0.02μmol/L(p＜0.01)，下調(diào)RbAp48表達(dá)后細(xì)胞對(duì)5-FU敏感性均顯著增加。4、①與空白組、陰性對(duì)照組相比，RbAp48-siRNA

17、組細(xì)胞出現(xiàn)明顯的衰老現(xiàn)象。②與空白組、陰性對(duì)照組相比，RbAp48-siRNA組細(xì)胞發(fā)生明顯G2/M期阻滯:轉(zhuǎn)染后第五天G2/M期細(xì)胞比例分別由(8.42±0.28)％、(13.33±2.94)％上升為(30.75±1.65)％(p＜0.01)。③與空白組、陰性對(duì)照組相比，RbAp48-siRNA組轉(zhuǎn)染第五天細(xì)胞凋亡率由(14.94±5.90)％、(16.02±2.12)％上升為(61.30±8.07)％(p＜0.01)。結(jié)論:1、Rb