miR-31在宮頸癌患者血漿中的表達(dá)及對宮頸癌細(xì)胞功能的影響.pdf

1、宮頸癌(cervical cancer)是最常見的女性生殖道惡性腫瘤，其死亡率在女性腫瘤中位居第二。高危型人類乳頭瘤病毒（HPV）持續(xù)感染，是引起宮頸癌前病變和宮頸癌的基本原因，單純HPV感染并不能直接導(dǎo)致宮頸癌發(fā)生，遺傳學(xué)和免疫學(xué)等因素也發(fā)揮重要作用。
　　微小RNA(miRNA)是一類小分子內(nèi)源性非編碼RNA，它與靶基因mRNA特異性結(jié)合，調(diào)控基因表達(dá)，在生命體生長、發(fā)育和細(xì)胞增殖、分化等生物學(xué)行為過程中起關(guān)鍵作用。miRNA

2、亦可促進(jìn)人類多種疾病的發(fā)生發(fā)展，尤其是腫瘤。
　　已有研究表明，miR-31在不同腫瘤中存在異常表達(dá)且參與細(xì)胞增殖、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞侵襲和遷移等生物學(xué)過程。我們前期研究發(fā)現(xiàn)，miR-31在宮頸癌組織中高表達(dá)，但miR-31在宮頸癌患者血漿中的表達(dá)尚未見報道。
　　本研究旨在檢測宮頸癌血漿中miR-31的表達(dá)水平，分析miR-31與宮頸癌患者臨床病理關(guān)系，探討miR-31對宮頸癌細(xì)胞增殖、遷移能力的影響。
　　第一部分血漿

3、中miR-31表達(dá)水平與宮頸癌臨床病理的關(guān)系
　　目的：探討miR-31在宮頸癌患者血漿中表達(dá)水平及其與臨床病理的關(guān)系。
　　方法：收集2013年1月至2015年12月廣西壯族自治區(qū)人民醫(yī)院婦科收治的60例宮頸癌患者術(shù)前血漿及正常對照組血漿，實時熒光定量PCR(Real-time PCR)檢測宮頸癌患者血漿中miR-31表達(dá)水平，分析miR-31的表達(dá)水平與臨床病理關(guān)系。
　　結(jié)果：miR-31在宮頸癌患者血漿中的相對

4、表達(dá)量明顯高于正常對照組，分別為2.96±0.67、1，差別具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。miR-31表達(dá)水平在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽性組較陰性組高，分別為3.03±0.11、2.64±0.08，差別具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。miR-31表達(dá)水平在脈管浸潤陽性組較陰性組高，分別為3.48±0.12、2.91±0.10，差別具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。miR-31表達(dá)水平在ⅡB2組、腫瘤直徑＞4cm組、年齡≥50歲組和中高分化組中增高，

5、分別為2.87±0.11、3.04±0.15、3.03±0.16、3.02±0.11，無統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05)。
　　結(jié)論：宮頸癌患者血漿中miR-31呈高表達(dá)，且與宮頸癌患者淋巴轉(zhuǎn)移、脈管浸潤密切相關(guān)。
　　第二部分 miR-31慢病毒載體的構(gòu)建及miR-31對宮頸癌細(xì)胞功能的影響
　　目的：構(gòu)建miR-31慢病毒表達(dá)載體，檢測miR-31對宮頸癌細(xì)胞生物學(xué)功能的影響。
　　方法：PCR擴增目的基因，將目的

6、基因與pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP載體質(zhì)粒經(jīng)限制性內(nèi)切酶XbaⅠ、BamHⅠ雙切后連接，將重組表達(dá)載體質(zhì)粒pCDH-miR-31送測序鑒定。用慢病毒質(zhì)粒系統(tǒng)包括pCDH-miR-31、pPACKH1-GAG、pPACKH1-REV和pVSV-G共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞包裝慢病毒，產(chǎn)生病毒液并測定滴度為3×107 TU/ml。慢病毒感染Hela細(xì)胞，用嘌呤霉素篩選穩(wěn)定表達(dá)miR-31的Hela細(xì)胞，Real-time RT-P

7、CR檢測Hela細(xì)胞中miR-31的表達(dá)水平。利用克隆形成實驗、MTT法及Transwell小室法檢測miR-31對細(xì)胞增殖、遷移能力的影響。
　　結(jié)果：重組載體質(zhì)粒pCDH-miR-31測序結(jié)果顯示，測序峰圖良好，插入片段與miR-31基因序列比對吻合度為99％。miR-31的表達(dá)水平在miR-31組較正常對照組明顯增高，分別為3.78±0.28、1.29±0.17，有統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.05)?？寺⌒纬蓪嶒烇@示，miR-31組

8、克隆形成率較正常對照組高，分別為41.16％±5.79％、28.60％±4.14％，有統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.05)。MTT結(jié)果顯示，miR-31對Hela細(xì)胞的增殖能力有促進(jìn)作用，在第五天最明顯，OD值分別為2.096±0.032，1.578±0.034，有統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.05)。細(xì)胞遷移實驗顯示，miR-31組較正常對照組遷移能力強，穿透基底膜細(xì)胞數(shù)分別為194.6±14.39、130.2±18.01個，有統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.05)