滑膜間充質干細胞向纖維軟骨分化的條件及分子機制研究.pdf

1、目的:探索滑膜間充質干細胞(SMSCs)穩(wěn)定地向纖維軟骨分化的充分必要條件，并在體外實驗中重復這一過程;進而初步探索這一過程調控的分子機制。方法:通過貼壁法和有限稀釋技術得到SMSCs，通過形態(tài)學、超微結構、分子表型、細胞代謝動力學、多向誘導分化等方法鑒定SMSCs并驗證其穩(wěn)定性、安全性、成軟骨能力、細胞活性和三向分化潛能等生物學特征。通過綜述文獻、模擬體內(nèi)環(huán)境等方法，經(jīng)過預實驗篩選后，使用L60(212)正交試驗探索SMSCs向纖維軟

2、骨分化的充分必要條件;正交試驗以纖維軟骨生成率為因變量，使用RT-PCR方法檢測纖維軟骨細胞的基因表達，使用甲苯胺藍等特異染色手段檢測軟骨特異性分子的表達，以計算軟骨生成率。通過反復試驗和比對探索出SMSCs向纖維軟骨分化并穩(wěn)定表達的最佳條件后，使用基因芯片的方法檢測這一過程差異表達的基因。基因芯片的8697個目的基因來源于文獻綜述，2153個基因序列來源于expressed sequence-tag(EST) library，6，54

3、4是根據(jù)NCBI databaseGenebank數(shù)據(jù)庫證實的基因構建，一些基因的開放性閱讀框太短，無法用于基因芯片，最終用于基因芯片檢測的基因有8605個。差異表達的基因再使用半定量RT-PCR的方法進一步驗證。使用Quackenbush的方法進行數(shù)據(jù)標準化和背景噪音的消除，使用Eisen的方法進行基因芯片數(shù)據(jù)分析，2倍表達差異作為差異表達的下限。此后進行基因功能分析。最后，針對基因芯片的表達結果和實驗中涉及的調控條件推論TGFβ-T

4、GFβ receptor-Smad2/3通路和BMP-BMP receptor-Smad1/5/8通路參與SMSCs成纖維軟骨過程中的調控，使用RT-PCR和Western-Blotting的方法在基因水平和蛋白水平證實纖維軟骨基因和調控因子間的關系，使用軟骨特異性染色和特異分子的染色鑒定這些分子在SMSCs誘導分化后的高表達。結果:SMSCs具有穩(wěn)定、安全、成軟骨能力強、細胞活性好、取材方便等特征。在SMSCs成纖維軟骨過程中TGFβ

5、1，BMP7，ASA，bFGF, IGF是最重要的調控因子，通過對這些因子的劑量和時序表達的改變，可以顯著的影響SMSCs成纖維軟骨的過程。其他細胞因子與前述因子存在交互，調控顯著性不及前述因子。除細胞因子外，機械環(huán)境氧濃度等亦是重要的調控作用，通過合理配置這些調控作用，能夠得到穩(wěn)定的纖維軟骨轉化率?；蛐酒C實，SMSCs成軟骨過程中，目標基因中1361基因差異表達，這些基因并不是持續(xù)高表達，而是隨時間變化不斷調整表達豐度。聚類分析顯

6、示，分化第21天的細胞與原始SMSCs的基因相似程度較高，而分化3、7、14天的細胞更加相似。主要功能基因的分析顯示無論是SMSCs原代細胞還是成纖維軟骨誘導后的細胞其增殖相關基因表達增高顯著，大部分的高表達基因在這一過程中的作用還不是非常清楚。TGFβ-TGFβ receptor-Smad2/3通路和BMP-BMP receptor-Smad1/5/8通路是兩條重要的調控通路，糖濃度和機械環(huán)境對SMSCs成纖維軟骨的調控通過前述通路實

7、現(xiàn)。許多調控通路中涉及大量未知的調控因子和旁路，即使是已知的通路中仍存在未知的作用。結論:SMSCs是理想的半月板組織工程種子細胞來源;合理的培養(yǎng)條件能得到SMSCs穩(wěn)定向纖維軟骨細胞分化的支架模型;這一過程涉及存在大量差異表達的基因且多數(shù)功能不清楚值得深入探索;TGFβ-TGFβ receptor-Smad2/3通路和BMP-BMP receptor-Smad1/5/8通路是兩條重要的基因調控通路，糖濃度和機械環(huán)境對SMSCs成纖維軟