脂肪間充質干細胞向心肌樣細胞分化的分子機制研究.pdf

1、[目的]：
　　1.將SD大鼠心肌細胞(CMs)與脂肪間充質干細胞(ASCs)共培養(yǎng)，以誘導ASCs分化為心肌樣細胞。
　　2.研究ASCs向心肌樣細胞分化的具體分子機制，探討Notch信號通路分子Notch1和Jagged1在分化過程中的作用。
　　3.加用DAPT（阻斷Notch信號通路的γ-secretase抑制劑），觀察ASCs分化為心肌樣細胞的比例是否下降或者不轉化，以證明Notch信號通路在ASCs增殖和分

2、化為心肌樣細胞過程中發(fā)揮著重要的靶向調控作用。
　　[方法]：
　　1.大鼠ASCs的分離與培養(yǎng)
　　采集SD大鼠腹股溝脂肪組織，采用膠原酶消化法分離、培養(yǎng)ASCs，觀察ASCs增殖、傳代和復蘇情況，并采用流式細胞儀進行ASCs鑒定（分析其表面抗原CD29、CD44、CD31、CD45的表達水平），并誘導ASCs向成骨、成脂方向分化，以鑒定其分化能力;
　　2.CMs的分離與培養(yǎng)
　　收集1～3d SD大鼠

3、乳鼠的心尖組織，進行酶消化并差速貼壁法分離純化出乳鼠CMs，觀察其活性和生長特點，并進行鑒定（免疫熒光檢測cTnⅠ和connexin43的表達）;
　　3.ASCs與CMs共培養(yǎng)
　　用CD29標記第4代ASCs后，將其與CMs共培養(yǎng)，觀察其生長情況，并進行cTnⅠ的免疫熒光檢測以鑒定ASCs是否轉化為心肌樣細胞;將生長狀態(tài)良好的第4代ASCs隨機分為3組，一組與心肌細胞混合培養(yǎng)為實驗組，一組加入DAPT后與心肌細胞混合培養(yǎng)

4、為阻斷組，一組單獨培養(yǎng)做對照組;
　　4.qRT-PCR、Western Blot檢測各組Notch信號通路分子Notch1和Jagged1表達;
　　[結果]：
　　1.成功分離、培養(yǎng)ASCs，第3代ASCs鑒定:CD29表達率97.78％±2.21％，CD31表達率為8.26％±1.47％，CD44表達率為43.90％±1.84％， CD45表達率為4.23％±1.91％，第3～5代ASCs表面抗原無明顯差異(p＞

5、0.05)，對照組陰性表達;
　　2.ASCs成脂、成骨誘導成功，成脂誘導細胞可見紅色圓形脂滴，成骨誘導可見玫瑰紅色鈣結節(jié);
　　3.成功分離、培養(yǎng)CMs，其cTnⅠ蛋白（呈紅色熒光）和connexin43蛋白（綠色熒光）皆為陽性表達; ASCs與CMs共培養(yǎng)后，呈現ASCs向心肌樣細胞分化，成功分化的帶有CD29標記的ASCs細胞cTnⅠ蛋白（呈紅色熒光）為陽性表達，而對照組則為陰性;
　　4.qRT-PCR檢測實驗

6、組Notch1和Jagged1的mRNA表達水平，較阻斷組或對照組明顯增加(p＜0.05)，阻斷組較對照組無統計學意義(p＞0.05);WesternBlot檢測實驗組Notch1和Jagged1表達較阻斷組或對照組增加(p＜0.05);阻斷組較對照組無統計學差異(p＞0.05);阻斷組ASCs分化為心肌樣細胞的比例較對照組明顯下降;帶有CD29標記的ASCs的cTnⅠ鑒定基本呈陰性。
　　[結論]：
　　1.SD大鼠ASC