重組艾塞那肽-人血清白蛋白融合蛋白臨床前藥代動力學(xué)研究.pdf

1、目的:
　　重組艾塞那肽-人血清白蛋白融合蛋白(E2HSA)臨床前藥代動力學(xué)研究。
　　方法:
　　建立化學(xué)發(fā)光酶聯(lián)免疫檢測法(CLEIA)測定獼猴血清中E2HSA的濃度并對其進行方法學(xué)確證;研究E2HSA在大鼠和獼猴體內(nèi)的藥代動力學(xué)特征;采用放射性同位素125I標(biāo)記法對E2HSA在大鼠體內(nèi)的組織分布和排泄特點進行研究。
　　結(jié)果:
　　1.測定生物樣品中藥物濃度的ELISA分析方法建立與確證
　　該

2、方法可特異性地識別E2HSA的抗原表位，在2～200ng·mL-1的濃度范圍時與血清中其它物質(zhì)無明顯交叉反應(yīng)。方法學(xué)確證表明標(biāo)準品E2HSA在2～200ng·mL-1濃度范圍內(nèi)，吸光度與濃度呈依賴關(guān)系，四參數(shù)Logistic擬合:Y（OD值）=A2+(A1-A2)/(1+(X/X0)^P)，相關(guān)系數(shù)r均大于0.99，最低定量限為2 ng·mL-1。批間和批內(nèi)精密度為1.3～8.1％，準確度為-3.6～2.3％。樣品在-20℃放置3個月穩(wěn)

3、定性良好，儲備液在-20℃放置7天穩(wěn)定性良好，稀釋1000倍無稀釋效應(yīng)。該分析方法能夠滿足E2HSA臨床前藥代動力學(xué)研究。
　　2.Wistar大鼠、獼猴皮下注射E2HSA的藥代動力學(xué)研究
　　Wistar大鼠單次皮下注射1.98 mg·kg-1E2HSA后， E2HSA在大鼠體內(nèi)消除半衰期t1/2為:12.2±1.2 h，平均滯留時間MRTlast為:34.9±1.9 h;血漿清除率CL為:19.1±5.6mL·h-1·k

4、g-1，表觀分布容積Vd為:381.4±50.7 mL·kg-1，AUClast為91652.8±8119.1ng·h·mL-1。獼猴單次皮下注射0.3、0.9和2.7 mg·kg-1E2HSA后，E2HSA在獼猴體內(nèi)消除半衰期t1/2依次為:53.4±8.0 h、50.9±9.1 h、56.8±8.1 h，三個劑量組間沒有統(tǒng)計學(xué)差異;平均滯留時間MRTlast依次為:78.3±6.2 h、89.0±7.6 h、83.3±7.7 h;消

5、除速率常數(shù)ke依次為:0.013±0.003、0.014±0.003、0.015±0.006;血漿清除率CL依次為:1.66±0.27 mL·h-1·kg-1、1.39±0.15 mL·h-1·kg-1、1.36±0.12 mL·h-1·kg-1，低劑量組和中劑量組有統(tǒng)計學(xué)差異，中劑量組合高劑量組沒有統(tǒng)計學(xué)差異，低劑量組和高劑量組有統(tǒng)計學(xué)差異;表觀分布容積Vd依次為:125.5±8.8 mL·kg-1、103.8±28.4 mL·kg-

6、1、110.4±12.2mL·kg-1三個劑量組間沒有統(tǒng)計學(xué)差異;AUClast依次為179182±27148 ng·h·mL-1，630956±68878 ng·h·mL-1，1928196±168615 ng·h·mL-1（比例1∶3.5∶10.8），低、中和高給藥劑量比為1∶3∶9，AUClast與給藥劑量基本呈等比例增加。
　　獼猴皮下注射0.9mg·kg-1E2HSA每周1次，連續(xù)5次給藥后，5只獼猴的蓄積因子(R)分別

7、為0.91、1.07、0.80、0.62和0.63，平均蓄積因子0.81±0.19。
　　獼猴皮下注射2.7mg·kg-1E2HSA對靜脈注射0.9mg·kg-1E2HSA的生物利用度為81.9％。
　　3.Wistar大鼠皮下注射125I-E2HSA的組織分布和排泄研究
　　組織分布結(jié)果可見2h活殺后各組織的藥物濃度順序為:血清＞肺＞胃內(nèi)容物＞腎＞脊髓＞小腸內(nèi)容物＞腎上腺＞胃＞卵巢＞心＞膀胱＞輸精管＞肝＞脾＞胰腺＞皮

8、膚＞小腸＞骨骼＞子宮＞輸卵管＞大腸＞胸腺＞睪丸＞腦＞肌肉＞大腸內(nèi)容物＞脂肪。8h活殺后各組織的藥物濃度順序為:血清＞肺＞腎上腺＞腎＞胃內(nèi)容物＞卵巢＞胃＞小腸內(nèi)容物＞輸卵管＞心＞輸精管＞肝＞小腸＞脾＞脊髓＞膀胱＞睪丸＞子宮＞皮膚＞胰腺＞大腸＞骨骼＞脂肪＞胸腺＞腦＞肌肉＞大腸內(nèi)容物。24h活殺后各組織的藥物濃度順序為:血清＞胃內(nèi)容物＞皮膚＞肺＞膀胱＞胃＞輸卵管＞腎＞卵巢＞輸精管＞小腸＞大腸內(nèi)容物＞腎上腺＞心＞子宮＞肝＞睪丸＞脾＞小腸內(nèi)容物＞

9、大腸＞骨骼＞胰腺＞脂肪＞脊髓＞胸腺＞肌肉＞腦。96h活殺后各組織的藥物濃度順序為:胃內(nèi)容物＞膀胱＞血清＞大腸內(nèi)容物＞腦＞皮膚＞肺＞腎＞腎上腺＞輸精管＞肝＞胃＞卵巢＞小腸內(nèi)容物＞輸卵管＞子宮＞脊髓＞心＞小腸＞脾＞大腸＞胰腺＞睪丸＞骨骼＞胸腺＞肌肉＞脂肪。
　　雄性Wistar大鼠在皮下給予125I-E2HSA(1.98mg·kg-1)后，0～144h內(nèi)從膽汁排泄的藥物量占總給藥量的3.97±1.29％。0～432h內(nèi)從尿液排泄的藥物

10、量占總給藥量的62.86±10.47％。0～432 h內(nèi)從糞便中排泄的藥物量占總給藥量為14.47±4.37％，代謝籠沾染回收到總給藥量的2.83％±0.63％。
　　結(jié)論:
　　1.測定生物樣品中藥物濃度的ELISA分析方法建立與確證
　　建立了簡單、靈敏、快速、可靠、特異性強的E2HSA全長藥物檢測方法，方法的特異性，準確度和精密度良好，符合生物分析方法指導(dǎo)原則要求。
　　2.Wistar大鼠、獼猴皮下注射E

11、2HSA的藥代動力學(xué)研究
　　E2HSA在獼猴體內(nèi)消除半衰期t1/2三個劑量組間沒有統(tǒng)計學(xué)差異;AUClast比例1∶3.5∶10.8，低、中和高給藥劑量比為1∶3∶9，AUClast與給藥劑量基本呈等比例增加，顯示在0.3 mg·kg-1～2.7 mg·kg-1的劑量范圍內(nèi)E2HSA在獼猴體內(nèi)的血清藥物濃度呈線性動力學(xué)變化。
　　獼猴皮下注射0.9mg·kg-1E2HSA每周1次，連續(xù)5次給藥后，平均蓄積因子0.81±0.

12、19，提示皮下注射0.9mg·kg-1E2HSA每周1次，連續(xù)5次后獼猴體內(nèi)血藥濃度不會積聚增加，其中部分獼猴血藥濃度會降低，推測可能有抗體產(chǎn)生。
　　獼猴皮下注射2.7mg·kg-1E2HSA的絕對生物利用度為81.9％，說明皮下注射可能是一種較為快速、方便、有效的用藥途徑。
　　3.Wistar大鼠皮下注射125I-E2HSA的組織分布和排泄研究
　　Wistar大鼠在皮下給予125I-E2HSA(1.98mg·k

13、g-1)后，分別于2h、8h、24h、96h動物活殺后各組織酸沉后放射性結(jié)果顯示:腎臟中藥物含量一直較高，提示經(jīng)尿排泄是一個主要的排泄途徑;藥物在脂肪、肌肉和腦組織中含量一直較低，說明E2HSA不易于進入脂性強的組織且不易透過血腦屏障;胃腸道中的含量一直較高，可能因為蛋白分解代謝中的堿性片段透過胃壁分泌到胃腸內(nèi)容物中。
　　膽汁、糞尿排泄結(jié)果顯示:糞便、尿液和代謝籠沾染共回收到總給藥量的80.16％，說明125I-E2HSA給藥后