生物樣品中五肽PEP801代謝分析及臨床前藥代動力學(xué)和毒代動力學(xué)研究.pdf

1、五肽PEP801(Met-Gln-Cys-Asn-Ser)是一種合成的小分子五肽，它是首次在痢疾阿米巴中提取產(chǎn)生，并被發(fā)現(xiàn)具有抗炎活性的的小分子五肽。在體內(nèi)能夠抑制人體單核吞噬細胞的活動，具有抗炎活性。近來有研究證明，五肽PEP801(Met-Gln-Cys-Asn-Ser)能夠保護腦缺血損傷，對腦缺血中風(fēng)具有治療意義。目前尚處于臨床前研究階段，國內(nèi)、外未見有關(guān)五肽PEP801(Met-Gln-Cys-Asn-Ser)藥代動力學(xué)研究的報

2、道。本文的工作旨在對其臨床前藥代動力學(xué)和毒代動力學(xué)作一整體評價，以支持人體藥代動力學(xué)研究并為臨床用藥及劑型開發(fā)提供參考依據(jù)。
　　 一、五肽PEP801代謝和穩(wěn)定性研究
　　 五肽PEP801(Met-Gln-Cys-Asn-Ser)含有甲硫氨酸和半胱氨酸，這兩個氨基酸殘基容易發(fā)生氧化，尤其是半胱氨酸含有巰基，容易發(fā)生金屬催化的氧化反應(yīng)。同時生物基質(zhì)中廣泛存在的各種蛋白水解酶容易使多肽類化合物快速降解，導(dǎo)致極短的半衰期。

3、因此本研究在實驗之初，用液相-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)詳細進行了五肽PEP801(Met-Gln-Cys-Asn-Ser)的代謝穩(wěn)定性研究。在溶液穩(wěn)定性考察中發(fā)現(xiàn)，酸性體系和有機相體系可以穩(wěn)定PEP801。但是在全血穩(wěn)定性中發(fā)現(xiàn)，抗氧劑、低溫和蛋白酶抑制劑均不能有效抑制PEP801的降解。而直接快速甲醇沉淀蛋白可以阻止PEP801的降解。同時通過PEP801在大鼠全血、肝勻漿和腎勻漿體外溫孵實驗中發(fā)現(xiàn)，全血和肝臟可能是PEP801代謝主要場所。而P

4、EP801在不同種屬SD大鼠、比格犬和人全血和肝微粒中代謝穩(wěn)定性研究發(fā)現(xiàn)，PEP801的降解速度: SD大鼠＞比格犬＞人。
　　 因此通過AB公司Q-Trap四極桿-線性離子阱串聯(lián)質(zhì)譜儀和Agilent6200高效液相色譜-高分辨飛行時間質(zhì)譜聯(lián)用系統(tǒng)兩種儀器對五肽PEP801在SD大鼠、比格犬以及人全血和肝微粒體體外溫孵樣本的主要代謝產(chǎn)物進行了鑒別。實驗結(jié)果表明:PEP801(Met-Gln-Cys-Asn-Ser)在生物基質(zhì)中

5、主要發(fā)生了肽鏈的斷裂，以及可能是肽鏈斷裂后進一步脫氫反應(yīng)。在生物基質(zhì)中總共發(fā)現(xiàn)四個主要代謝產(chǎn)物和兩個微量代謝產(chǎn)物。四個主要代謝產(chǎn)物為M1(Asn-Ser)、 M2(Gln-Cys)、M3(Cys-Asn)和M4(Met-Gln-Cys-Asn);兩個微量代謝產(chǎn)物為M5(Gln-Cys-Asn)，而M6可能為M3(Cys-Asn)進一步脫氫的代謝產(chǎn)物。大鼠、比格犬與人全血、肝微粒體體外溫孵代謝物分布基本類似，因此大鼠和比格犬可以作為毒性研

6、究的種屬。
　　 通過固相合成四個主要主要代謝產(chǎn)物M1(Asn-Ser)、M2(Gln-Cys)、M3(Cys-Asn)和M4(Met-Gln-Cys-Asn)，用液質(zhì)聯(lián)用方法對大鼠體內(nèi)全血樣本進行定量、定性分析。發(fā)現(xiàn)二肽M1(Asn-Ser)為相對穩(wěn)定和降解較慢的主要代謝產(chǎn)物?？紤]到五肽PEP801極短的半衰期，同時測定二肽M1(Asn-Ser)在全血中的濃度，可以表征五肽PEP801(Met-Gln-Cys-Asn-Ser)

7、在體內(nèi)的藥代和毒代動力學(xué)過程。
　　 二、SD大鼠、比格犬全血中PEP801和代謝產(chǎn)物二肽(ASN-SER)分析方法的建立
　　 用液相-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)進行五肽PEP801(Met-Gln-Cys-Asn-Ser)和二肽(Asn-Ser)在SD大鼠、比格犬全血中濃度的方法學(xué)研究。PEP801在全血中極不穩(wěn)定，直接用含有0.2％甲酸的甲醇立刻進行蛋白沉淀，可阻止蛋白酶對PEP801的降解，并進一步進行蛋白沉淀前處理。同時根據(jù)

8、快速定量取血要求，在大鼠取血時用100μl的定量毛細管在眼眶定量取血方式;而比格犬采用0.5 ml的定量胰島素注射器準確取血100μl方式進行快速定量取血。取血完畢后立刻置于先前加有0.2％甲酸的甲醇中進行樣本前處理。
　　 在液質(zhì)聯(lián)用方法建立過程中，考慮到五肽PEP801(Met-Gln-Cys-Asn-Ser)和其主要代謝產(chǎn)物二肽M1(Asn-Ser)不同的化學(xué)屬性，用不同的液相分離條件分別測定PEP801和二肽(Asn-S

9、er)在大鼠、比格犬全血中的濃度，并同時對其進行了系統(tǒng)的方法學(xué)驗證。經(jīng)驗證，方法的準確度、精密度、靈敏度、專屬性及定量線性等均符合生物樣品的分析要求，可用于SD大鼠、比格犬藥代動力學(xué)和毒代動力學(xué)研究。
　　 三、PEP801在動物體內(nèi)的藥代動力學(xué)研究
　　 利用建立的液質(zhì)聯(lián)用方法進行了大鼠靜脈給藥0.5 mg/kg、1 mg/kg、2 mg/kg三個劑量以及比格犬靜脈推注0.2 mg/kg、0.4 mg/kg、0.6 m

10、g/kg三個劑量的藥代動力學(xué)研究。
　　 SD大鼠靜脈注射PEP8010.5 mg/kg、1 mg/kg、2 mg/kg三個劑量后體內(nèi)半衰期極短，降解快速。PEP801和代謝物二肽(Asn-Ser)的藥時曲線的末端相消除半衰期(t1/2)分別為0.24±0.02 min、0.24±0.01min、0.28±0.03 min以及1.94±0.04 min、2.93±0.23 min、2.81±0.06 min; PEP801和二肽

11、(Asn-Ser)的AUC0-τ分別為65.46±3.17ng·min/mL、154.51±6.90 ng·min/ml、355.19±15.43 ng·min/ml和1133.28±32.70ng·min/ml、2385.88±83.26 ng·min/ml、4263.99±74.85 ng·min/ml。 PEP801(Met-Gln-Cys-Asn-Ser)和二肽(Asn-Ser)的AUC0-τ與給藥劑量基本呈正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別

12、為r2=0.9936和r2=0.9921?？烧J為在該劑量水平下，SD大鼠體內(nèi)藥代動力學(xué)行為是線性的。鑒于其較短的半衰期，血藥濃度維持時間極短。臨床中建議采用靜脈滴注給藥。
　　 而比格犬模擬臨床用藥采用靜脈推注給藥方式，靜脈推注PEP801(Met-Gln-Cys-Asn-Ser)0.2 mg/kg、0.4 mg/kg、0.6 mg/kg三個劑量給藥后體內(nèi)半衰期極短，降解快速。PEP801和二肽(Asn-Ser)的藥時曲線的末端

13、相消除半衰期(t1/2)分別為0.47±0.05 min、0.40±0.05 min、0.56±0.06 min以及8.55±0.47 min、12.50±1.42 min、13.06±1.20 min; PEP801和代謝物二肽(Asn-Ser)的AUC0-τ分別為1546.09±65.50ng·min/ml、2675.17±54.4 ng·min/ml、6666.53±151.43 ng·min/ml和1258.04±102.95n

14、g·min/ml、2771.37±103.71 ng·min/ml、5117.49±352.76 ng·min/ml。PEP801和代謝物二肽(Asn-Ser)的AUC0-τ與給藥劑量基本呈正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為r2=0.9763和r2=0.9833?？烧J為在該三個劑量水平下，比格犬內(nèi)藥代動力學(xué)行為是線性的。
　　 四、PEP801在動物體內(nèi)的毒代動力學(xué)研究
　　 利用建立的液質(zhì)聯(lián)用方法進行SD大鼠和比格犬28天多劑量靜

15、脈慢推給藥15mg/kg、30 mg/kg、60 mg/kg三個劑量組的毒代動力學(xué)研究。具體分析與綜合比較毒代動力學(xué)研究給藥首日和給藥末期相應(yīng)的SD大鼠體內(nèi)PEP801(Met-Gln-Cys-Asn-Ser)及其代謝產(chǎn)物二肽(Asn-Ser)實驗數(shù)據(jù)。
　　 SD大鼠28天長期毒性條件下，考慮動物個體差異，低劑量、中劑量、高劑量組對應(yīng)的SD大鼠體內(nèi)PEP801(Met-Gln-Cys-Asn-Ser)及其代謝產(chǎn)物二肽(Asn-

16、Ser)的最大血藥濃度(C0)、各自單位劑量的藥時曲線下面積AUC0～τ/Dose以及血藥全身清除率(Cl)隨多劑量給藥次數(shù)與時間的推移無明顯變化(p＞0.05)。因此，從體內(nèi)PEP801及其代謝產(chǎn)物二肽(Asn-Ser)主要毒代動力學(xué)參數(shù)角度，提示在低劑量、中劑量及高劑量三個劑量組28天長期、多劑量靜脈慢推給藥過程中，藥物對機體沒有明顯損傷，并未造成藥代、毒代屬性的明顯變化。
　　 比格犬28天長期毒性條件下，考慮動物個體差異

17、，低劑量、中劑量、高劑量組對應(yīng)的比格犬體內(nèi)PEP801及其代謝產(chǎn)物(Asn-Ser)的靜脈推注給藥完畢后即刻血藥濃度(C0)、各自單位劑量的藥時曲線下面積AUC0～τ/Dose以及血藥全身清除率(Cl)隨多劑量給藥次數(shù)與時間的推移無明顯變化(p＞0.05)。因此，從體內(nèi)PEP801(Met-Gln-Cys-Asn-Ser)及其代謝產(chǎn)物(Asn-Ser)主要毒代動力學(xué)參數(shù)角度，提示在低劑量、中劑量及高劑量三個劑量組28天長期、多劑量靜脈慢