長效人血清白蛋白的制備及其生物功能與藥代動力學研究.pdf

1、人血清白蛋白（humanserumalbumin，HSA）是人血漿中含量最豐富的蛋白質，濃度可達42±3.5g/L。HSA提供80％的血漿膠體滲透壓(colloidosmoticpressure，COP)，其臨床藥效主要為血容量擴充、維持血漿膠體滲透壓和血液稀釋等。HSA臨床適應癥廣泛，包括血容量不足、出血性休克、燒傷、白蛋白減少癥、急性肝損傷、腹水、外科手術、急性呼吸窘迫綜合征和血液透析等。
　　 近年來，由于血液來源短缺等原

2、因致使HSA供應十分緊張，如何解決HSA的來源緊缺問題已成為目前HSA研究的熱點?；诖?，科研工作者主要圍繞以下兩個方面展開研究，尋找HSA的替代品，一是利用聚乙二醇(polyethyleneglycol,PEG)對非人源白蛋白進行修飾以消除其免疫原性，但其安全性讓人擔憂;二是利用基因重組技術生產重組人血清白蛋白（recombinantHSA，rHSA）。目前，HSA已在細菌、真菌、植物及動物中成功表達，但由于HSA臨床應用劑量較大（每

3、次可達5～10g）和rHSA產率較低等原因，實現高純度、低成本的藥物級rHSA的大規(guī)模生產是個極具挑戰(zhàn)性的課題。
　　 此外，HSA的臨床應用也存在一定局限性。如在燒傷、感染或失血等病理情況下，血管內皮細胞損傷，毛細血管通透性增加，血容量下降，及時有效地進行血容量擴充非常重要。然而毛細管滲透性增加可加速HSA的血管外滲，導致HSA血容量擴充作用維持時間較短，引起或加重組織水腫，不利于病情緩解。
　　 針對以上HSA來源短

4、缺和血管保留率低等問題，本課題設想:采用PEG對HSA進行共價修飾，PEG分子具有巨大的水化體積，與HSA偶聯后將賦予HSA較大的分子半徑，從而減少血管滲漏，增加外源性輸注的HSA的血管保留率，使其充分發(fā)揮血容量擴充作用;同時PEG修飾能顯著改善蛋白質藥物的藥代動力學性質，對HSA進行PEG修飾有望延長其生物半衰期，降低用藥頻率，在藥物經濟學方面也具有一定意義。
　　 本課題的主要研究內容及取得的成果有以下幾個方面:
　　

5、 1.HSA的分離純化及PEG定點和隨機修飾產物的制備
　　 PEG修飾反應原料的純度與修飾產物的均一性和反應產率密切相關，為了提高反應產率獲得均一性良好的PEG修飾產物，本實驗采用SephacrylS-200凝膠柱層析和超濾法對血漿來源的HSA進行分離純化。利用HSA分子上唯一的半胱氨酸殘基，以相對分子質量（Mr）為20kDa的單甲氧基聚乙二醇-馬來酰亞胺(mPEG-MAL)為修飾劑，對HSA進行Cys34定點修飾;利用N-

6、末端氨基酸殘基上的α-氨基和HSA主鏈上賴氨酸上的ε-氨基的pKa值不同，以單甲氧基聚乙二醇-丙醛(mPEG-ALD)為修飾劑，對HSA進行N-末端定點修飾。采用單因素分析和正交試驗優(yōu)化反應條件，確定最佳反應條件。修飾產物經DEAESepharoseFF柱層析和超濾法兩步分離純化，獲得Cys34定點修飾產物(PEG-cys34HSA)和N-末端定點修飾產物(N-terminalPEG-HSA)。同時采用氰尿酰氯活化的PEG對HSA進行隨

7、機修飾，制備Mr相當的隨機修飾產物(randomPEG-HSA)，以作為體內外性質測定的對照品。
　　 結果顯示，SephacrylS-200凝膠柱層析和超濾法兩步純化可顯著提高HSA純度，HSA的純度由純化前的91％提高到99.8％。mPEG-MAL與HSA的最佳反應條件經單因素分析確定為:pH6.5、50mmol/L磷酸鹽緩沖液(含10mmol/LEDTA);HSA濃度為5mg/mL;HSA∶PEG摩爾比為1∶2;37℃水浴

8、搖床振搖20h，該最佳反應條下修飾產率達到50％以上。經SDS-PAGE檢測粗略估計修飾產物的Mr約為90kDa，證實該修飾產物為單修飾產物。mPEG-ALD與HSA的最佳反應條件為:pH6.0、10mmol/L磷酸鹽緩沖液;HSA∶PEG摩爾比為1∶3;HSA濃度為5mg/mL;在反應結束前6h加還原劑NaCNBH3;4℃反應36h。按照以上優(yōu)化的反應條件制備的HSA的N-末端定點修飾產物(N-terminalPEG-HSA)均一性好

9、，SDS-PAGE檢測單修飾率可達35％。PEG-cys34HSA和N-terminalPEG-HSA經DEAESepharoseFF柱層析和超濾法兩步法純化所得樣品經SDS-PAGE檢測純度可達95％和91％。氰尿酰氯活化的PEG-6000與HSA的修飾產物分子量分布廣泛，采用DEAECellulose柱層析和超濾法獲得平均分子量約為90kDa左右的隨機修飾產物，與定點修飾產物Mr相當，可作為體內外性質測定的對照品。
　　 2

10、.HSA及其PEG修飾產物的性質測定
　　 對HSA及其PEG修飾產物(PEG-cys34HSA、N-terminalPEG-HSA和randomPEG-HSA)的理化性質和修飾參數進行分析鑒定，主要包括修飾產物的二級結構、分子量、修飾位點和流體力學半徑等。
　　 結果顯示:利用圓二色譜法(CD)測定HSA及其PEG修飾產物的二級結構變化情況，修飾前后HSA的CD圖譜峰形類似，幾乎完全重合，這說明兩者的二級結構幾乎完全一

11、致，提示PEG修飾并未影響HSA的二級結構;采用動態(tài)激光散射法(DLS)測得HSA、PEG-cys34HSA和N-terminalPEG-HSA的流體力學半徑(Rh)分別為7.81、47.25和50.74nm，HSA經PEG修飾后，Rh增加為原來的6～6.5倍，HSA在水溶液中的流體力學半徑顯著提高;采用N-乙基馬來酰亞胺(NEM)封閉法確定PEG-cys34HSA的修飾位點，SDS-PAGE證實NEM處理的HSA不能發(fā)生PEG化反應，

12、以此證實修飾反應發(fā)生在唯一一個游離半胱氨酸-34位半胱氨酸;采用高效凝膠滲透色譜-多角度激光散射聯用法(GPC-MALS)測定N-terminalPEG-HSA的Mr為83.71kDa，確定該修飾產物為單修飾產物。
　　 3.HSA及其PEG修飾產物的藥物結合性質研究
　　 HSA是人血漿中含量最為豐富的一種載體蛋白，研究藥物與HSA及其修飾產物的結合性質，對于了解藥物在體內的轉運、分布以及代謝過程具有重要意義。本實驗采

13、用表面等離子共振技術(SPR)研究了兩種模型藥物（華法林和萘普生）與HSA及其PEG修飾產物的相互作用。
　　 結果顯示，SPR技術能夠準確反映HSA及其PEG修飾物與藥物的結合水平。采用解離平衡常數（KD）衡量配基（華法林和萘普生）與受體（HSA及其PEG修飾產物）的相互結合能力，KD值愈小結合能力愈大。華法林與HSA、PEG-cys34HSA、N-terminalPEG-HSA和randomPEG-HSA相互作用的KD值分別

14、為:12.9、24、14.2和67.6μmol/L，萘普生與HSA、PEG-cys34HSA、N-terminalPEG-HSA和randomPEG-HSA相互作用的KD值分別為24.6、36、27.7和44.7μmol/L。不同修飾位點對結合能力影響不盡相同，定點修飾對HSA與藥物結合影響作用較小，與Cys34定點修飾相比，N-末端氨基定點修飾對HSA與藥物的親和力影響較小。而隨機修飾由于其修飾位點較多且修飾位點不確定，能夠明顯降低H

15、SA與藥物的親和力。
　　 4.人血清白蛋白及其PEG修飾產物在小鼠體內的藥代動力學和組織分布研究
　　 本實驗采用125I放射標記法和三氯乙酸(TCA)沉淀法研究HSA及其PEG修飾產物在小鼠體內的血漿半衰期和組織分布等性質。結果顯示，HSA及其PEG修飾產物在小鼠的體內過程符合二室模型，HSA、PEG-cys34HSA、N-terminalPEG-HSA和randomPEG-HSA的消除半衰期（t1/2β）分別為9.

16、51±2.22、21.91±2.00、22.50±1.70和22.93±1.51h，PEG修飾后t1/2延長為未修飾前的2.3～2.4倍左右。同時可以觀察到，修飾產物的藥時曲線下面積(AUC)和平均保留時間(MRT)都較未修飾前增大，血漿清除率(CL)也有所降低，以上結果均提示PEG修飾能夠改善HSA在體循環(huán)的保留率。各修飾產物與HSA相比，各時間點的組織分布量相當，并未顯示明顯的組織分布特異性。
　　 5.HSA及其PEG修飾

17、產物在急性肺損傷模型中的毛細血管透過率和對膿毒癥的藥效學研究
　　 本實驗采用內毒素脂多糖(LPS)吸入給藥誘導小鼠急性肺損傷(ALI)模型，引起肺部毛細血管通透性增加，考察HSA及其PEG修飾產物在肺部毛細血管的滲出;利用LPS尾靜脈注射誘導大鼠膿毒血癥模型，以大鼠的紅細胞壓積(Hct)和平均動脈壓(MAP)為考察指標，評價PEG-cys34HSA對大鼠膿毒血癥的治療作用。
　　 肺部毛細血管的透過率結果顯示，三種修飾

18、產物給藥組的血管滲出量明顯低于HSA，提示PEG修飾可有效減少HSA向肺實質的滲漏。HSA和定點修飾產物PEG-cys34HSA對膿毒血癥的藥效學研究結果顯示，LPS給藥后2h，各組的Hct均呈現上升趨勢，MAP也呈現大幅度下降，降幅大于40mmHg，以上結果提示造模成功。HSA與PEG-cys34HSA給藥后2h，HSA給藥組的MAP由92±6mmHg上升為98±15mmHg，而PEG-cys34HSA給藥組的MAP由92±12mmH

19、g升至117±7mmHg，上升幅度明顯高于HSA組(P＜0.05)。同時，各組在給與液體輸注后2h，Hct均有所降低，表現為血液稀釋，血容量升高，其中PEG-cys34HSA血液稀釋作用強于生理鹽水組和HSA組(P＜0.05)，提示PEG-cys34HSA可更有效地擴充血容量。
　　 本研究取得的主要成果和結論:
　　 1.采用mPEG-MAL和mPEG-ALD為修飾劑，與HSA反應能夠獲得均一的定點單修飾產物，修飾反應

20、條件溫和、操作簡單、重復性好、單修飾率較高。采用DEAESepharoseFF柱層析和超濾法兩步純化可獲得純度較高的修飾產物。
　　 2.PEG修飾對HSA的二級結構影響較小，可顯著增加修飾蛋白的水化半徑。
　　 3.不同修飾位點對PEG修飾產物與小分子藥物的結合能力影響不盡相同，定點修飾對HSA與藥物結合影響作用較小，而隨機修飾能夠明顯降低HSA與藥物的親和力。
　　 4.PEG修飾可延長HSA的消除半衰期，改