直鏈和支鏈PEG定點(diǎn)修飾對(duì)人血清白蛋白結(jié)構(gòu)和藥效學(xué)的影響以及PEg-人血清白蛋白的藥代動(dòng)力學(xué)研究.pdf

1、研究背景及目的
　　人血清白蛋白(human serum albumin，HSA)是一種調(diào)劑體內(nèi)液體分布的最重要的調(diào)節(jié)劑，維持著血漿內(nèi)80％的膠體滲透壓(colloid osmotic pressure，COP)，也是在血液中運(yùn)輸許多內(nèi)源性化合物（例如脂肪酸、血紅素、膽紅素等）的重要載體。HSA在臨床上有著非常重要和廣泛的用途，其適應(yīng)證包含燒傷、白蛋白減少癥、出血性休克、血容量不足、腹水、急性呼吸窘迫綜合征等。但是，目前HSA在臨

2、床上的應(yīng)用存在著諸多爭(zhēng)議，這主要是由于機(jī)體在燒傷、失血等病理?xiàng)l件下血管內(nèi)皮細(xì)胞常常會(huì)受到損傷，從而造成毛細(xì)血管的間隙增加，血管通透性增大。此時(shí)，應(yīng)用HSA進(jìn)行血容量擴(kuò)充，輸注到血管內(nèi)的HSA會(huì)滲透到組織間隙中，造成組織水腫，進(jìn)一步加重疾病的病情。另外，由于HSA的臨床應(yīng)用劑量較大，目前雖然應(yīng)用基因工程技術(shù)已經(jīng)能夠成功表達(dá)生產(chǎn)出重組HSA，但實(shí)現(xiàn)高純度、大規(guī)模的生產(chǎn)仍然面臨著很大的挑戰(zhàn)。因此，以血液為主要來源的HSA的供應(yīng)仍舊十分緊張。<

3、br>　　針對(duì)HSA在臨床應(yīng)用中由于血管通透性增加所導(dǎo)致的滲出增加以及HSA來源較為緊張的問題，本實(shí)驗(yàn)室采用高相對(duì)分子質(zhì)量（relative molecular mass,Mr）的PEG對(duì)HSA進(jìn)行定點(diǎn)修飾，設(shè)想通過PEG修飾增大HSA的分子半徑來減少HSA在血管內(nèi)的滲漏、延長其半衰期、提高其用藥安全性、降低其用藥頻率。本實(shí)驗(yàn)室在以往的研究中通過動(dòng)態(tài)光散射和圓二色譜法證實(shí)了高M(jìn)rPEG定點(diǎn)修飾可顯著增加HSA的流體力學(xué)半徑且不影響HSA

4、的二級(jí)結(jié)構(gòu);通過125I放射標(biāo)記法對(duì)HSA及其PEG修飾產(chǎn)物的藥代動(dòng)力學(xué)研究，證實(shí)了PEG-HSA的在體內(nèi)的半衰期顯著延長;通過小鼠急性肺損傷模型和大鼠膿毒血癥模型證實(shí)了PEG修飾可有效減少HSA從血管的滲漏，能更有效地發(fā)揮血容量擴(kuò)充的作用。
　　本論文在本實(shí)驗(yàn)室以往的研究基礎(chǔ)上，通過研究20 kDa直鏈和支鏈PEG定點(diǎn)修飾的HSA在大鼠失血性休克模型中作為血容量擴(kuò)充劑的療效，考察PEG修飾對(duì)HSA作為血容量擴(kuò)充劑的影響和其相關(guān)機(jī)

5、制，并考察支鏈PEG修飾的HSA是否具有藥效學(xué)的優(yōu)勢(shì);利用小角散射技術(shù)研究不同Mr和不同構(gòu)型的PEG在HSA表面的空間取向和對(duì)蛋白結(jié)構(gòu)的影響，并采用表面等離子共振技術(shù)(surfaceplasmon resonance，SPR)研究其對(duì)于臨近Cys34的血紅素結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合能力的影響;通過采用Nano液相-串聯(lián)質(zhì)譜（nanoliquid chromatography tandem masschromatography，NanoLC-MS/M

6、S）檢測(cè)PEG-HSA經(jīng)酶解后的肽段來對(duì)完整的PEG-HSA進(jìn)行定量，建立了一種新的高靈敏度、高選擇性地對(duì)大鼠血漿中的PEG-HSA進(jìn)行定量的方法，以解決放射性同位素不穩(wěn)定、易脫落的問題，為更準(zhǔn)確地反映藥物真實(shí)的藥代動(dòng)力學(xué)情況提供新的方法。
　　本論文的主要研究?jī)?nèi)容、研究方法和研究結(jié)果
　　1PEG定點(diǎn)修飾的HSA用于失血性休克血液復(fù)蘇的研究
　　方法:本論文采用大鼠的失血性休克模型，以生理鹽水、8％HSA和25％HS

7、A作為對(duì)照，考察了直鏈和支鏈的20 kDaPEG定點(diǎn)修飾的HSA作為血容量擴(kuò)充劑的血液復(fù)蘇療效和對(duì)再灌注損傷的影響。利用大鼠的平均動(dòng)脈壓和血?dú)鈪?shù)來反映大鼠在失血性休克和血液復(fù)蘇治療中的整體狀態(tài);利用血液流變學(xué)參數(shù)來評(píng)價(jià)不同的血容量擴(kuò)充劑對(duì)大鼠血液中紅細(xì)胞性質(zhì)和血液黏度的影響。血液及組織中內(nèi)皮型NO合酶(endothelial nitric oxide synthase，eNOS)和單核細(xì)胞趨化蛋白-1(monocyte chemota

8、ctic protein-1，MCP-1)的含量分別與血管壁的剪切應(yīng)力和血管的收縮擴(kuò)張有關(guān)，因此本論文利用MCP-1和eNOS來評(píng)價(jià)血液復(fù)蘇后微血管的狀態(tài)。另外，本論文通過對(duì)炎癥相關(guān)因子腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、核因子-κB(nuclear factor-κB，NF-κB)和凋亡相關(guān)蛋白bax、bcl-2進(jìn)行了檢測(cè)，同時(shí)結(jié)合對(duì)大鼠肺部組織進(jìn)行的蘇木素/伊紅(haematoxylin

9、and eosin，HE)染色，全面研究實(shí)驗(yàn)中大鼠肺部組織的再灌注損傷情況，綜合評(píng)價(jià)PEG修飾的HSA用于失血性休克血液復(fù)蘇的防護(hù)作用及機(jī)制。
　　結(jié)果:在血液復(fù)蘇90 min時(shí)，直鏈和支鏈20 kDaPEG定點(diǎn)修飾的HSA（L-PEG-HSA和Y-PEG-HSA）組大鼠的平均動(dòng)脈壓分別為（91.00±2.10）mmHg、（91.83±1.17）mmHg，要顯著高于生理鹽水組（（67.29±4.46）mmHg）、8％HSA(HSA

10、8)組（（73.17±5.95)mmHg）、25％HSA(HSA25)組（（83.00±2.53)mmHg）。兩組PEG-HSAs實(shí)驗(yàn)組的PaO2、pH、Hb、BE等血?dú)庵笜?biāo)與休克結(jié)束時(shí)相比也有顯著性地改善。這表明，與HSA相比，PEG-HSAs能在相對(duì)更長的時(shí)間內(nèi)發(fā)揮更有效的血容量擴(kuò)充作用，能更有效地提高大鼠的平均動(dòng)脈壓、血?dú)鈪?shù)。另外，PEG-HSAs能促進(jìn)大鼠體內(nèi)的MCP-1和eNOS的表達(dá)，顯著提高全血低切還原黏度和血漿黏度。W

11、estern blot實(shí)驗(yàn)和HE病理染色的結(jié)果則表明，HSA25、L-PEG-HSA和Y-PEG-HSA三種高滲透性的血容量擴(kuò)充劑能夠顯著抑制肺組織炎癥相關(guān)因子（TNF-α，NF-κB）和凋亡相關(guān)蛋白(bax，bcl-2)的表達(dá)，減輕肺部組織的再灌注損傷。
　　本論文未發(fā)現(xiàn)支鏈PEG修飾的HSA具有療效上的優(yōu)勢(shì)。而值得注意的是，血液復(fù)蘇結(jié)束后，PEG-HSAs組大鼠血液的血沉方程K值有所增加(L-PEG-HSA，4.38±1.01

12、; Y-PEG-HSA，5.06±0.36)，與生理鹽水組（3.51±0.55）、HSA8（3.24±0.46）和HSA25（3.20±0.81）實(shí)驗(yàn)組相比有顯著性差異，其中Y-PEG-HSA實(shí)驗(yàn)組表現(xiàn)得尤為明顯。另外，與生理鹽水組（0.92±0.08）相比，HSA（HSA8，1.04±0.08;HSA25，1.11±0.28）能夠增加血液紅細(xì)胞的變形性指數(shù)，但是PEG修飾會(huì)減弱HSA的這一功能，特別是Y形PEG修飾(L-PEG-HSA

13、，1.05±0.04; Y-PEG-HSA，0.95±0.06)。
　　2PEG定點(diǎn)修飾的HSA在溶液中的結(jié)構(gòu)以及藥物結(jié)合性質(zhì)的研究
　　方法:本論文采用小角中子散射的方法研究了直鏈5kDa、10 kDa、20 kDa和40 kDa PEG和支鏈20 kDa、40 kDa PEG定點(diǎn)修飾HSA的Cys34后所得PEG-HSAs聚合物在溶液中的構(gòu)象;還采用表面等離子共振技術(shù)(surface plasmonresonance，S

14、PR)研究不同Mr和不同構(gòu)型的PEG修飾對(duì)于臨近HSA Cys34的血紅素結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合能力的影響。
　　結(jié)果:HSA、PEG5kD-HSA、PEG10kD-HSA、PEG20kD-HSA、Y-PEG20kD-HSA、PEG40kD-HSA、Y-PEG40kD-HSA的旋轉(zhuǎn)半徑分別為2.27±0.01、2.42±0.04、2.44±0.01、2.52±0.01、2.61±0.02、2.50±0.02、2.60±0.04 nm;分子最

15、大直徑分別為6.22±0.04、6.79±0.1、6.97±0.07、7.07±0.04、7.36±0.11、7.00±0.00、7.49±0.23 nm。這表明，經(jīng)PEG修飾后，HSA在溶液中的構(gòu)象有所延伸擴(kuò)展，分子直徑增加。支鏈PEG修飾的HSA相對(duì)于同等Mr的直鏈PEG修飾的HSA擁有相對(duì)更大的旋轉(zhuǎn)半徑(the radii of gyration，Rg)和最大直徑(the maximumdimension ofthe scatte

16、ring particle，Dmax)。Y-PEG40kD-HSA的散射曲線在小q處的干擾峰最為明顯。結(jié)合電泳圖中Y-PEG40kD-HSA比相同Mr的直鏈PEG修飾的PEG40kD-HSA的表觀Mr明顯大很多，表明支鏈PEG的空間結(jié)構(gòu)有較大的空間位阻，也能賦予HSA更強(qiáng)的分子間相互排斥作用。HSA和PEG-HSAs的P(R)函數(shù)的最大峰值M對(duì)應(yīng)的r均在3 nm左右，表明直鏈和支鏈不同Mr的PEG修飾對(duì)蛋白質(zhì)自身的結(jié)構(gòu)幾乎沒有影響。利用

17、DAMMIN對(duì)小角散射的數(shù)據(jù)進(jìn)行重頭建模得到的HSA和PEG-HSA在溶液中的三維構(gòu)象表明，偶聯(lián)在HSA表面的PEG自己形成一個(gè)無規(guī)則線團(tuán)覆蓋在HSA表面上，與HSA更傾向于彼此之間相互影響作用形成一個(gè)類似球體的PEG-HSA的復(fù)合物。與相同Mr的線性PEG相比，支鏈PEG的兩條鏈雖然連接在同一個(gè)末端，但是彼此分別在HSA表面形成兩個(gè)獨(dú)立的相互排斥的無規(guī)則線團(tuán)。
　　HSA、 PEG5kD-HSA、 PEG10kD-HSA、 PE

18、G20kD-HSA、Y-PEG20kD-HSA、PEG40kD-HSA、Y-PEG40kD-HSA與血紅素作用的為平衡解離常數(shù)(equilibriumdissociation constant, KD)分別為(5.10±0.70)×10-9、(46.83±3.70)×10-9、(7.75±2.03)×10-9、(9.04±0.42)×10-9、(7.18±1.88)×10-9、(84.43±0.74)×10-9、(26.53±2.87)

19、×10-9mol/L，這表明直鏈PEG5kD、直鏈PEG40kD和支鏈PEG40kD修飾大大降低了HSA和血紅素結(jié)合的親和力，而直鏈PEG10kD、直鏈PEG20kD和支鏈PEG20kD對(duì)HSA和血紅素的結(jié)合基本沒有影響。
　　3大鼠血漿中PEG-HSA基于NanoLC-MS/MS的定量分析方法的建立
　　本論文通過采用Nano液相-串聯(lián)質(zhì)譜(nanoliquid chromatography tandemmass chro

20、matography，NanoLC-MS/MS)檢測(cè)PEG-HSA經(jīng)酶解后的肽段來對(duì)完整的PEG-HSA進(jìn)行定量，建立了一種新的PEG-HSA在大鼠血漿中含量的測(cè)定方法，該方法選擇性好、靈敏度高。采用液液萃取法，利用與水混溶的酸性有機(jī)溶劑從血漿中提取待測(cè)物PEG-HSA與內(nèi)標(biāo)PEG-BSA，色譜分析采用自制的納流C18柱（直徑75μm，長度150 mm）。采用PEG-HSA經(jīng)酶解后的HPYFYAPELLFFAK肽段和PEG-BSA酶解后

21、的HPYFYAPELLYYANK肽段進(jìn)行定量，用于這兩個(gè)肽段定量分析的離子反應(yīng)分別為m/z581.6→779.4和m/z936.0→1491.9。采用甲酸(formic acid，F(xiàn)A)和乙腈(acetonitrile，ACN)作為流動(dòng)相試劑，流動(dòng)相A相為0.1％FA/H20、B相為0.1％FA/ACN，流速為300 nl/min，進(jìn)樣梯度為5 min8％B、45 min35％B、50 min90％B、60 min90％B。在50～30

22、00ng/mL的濃度范圍內(nèi)線性表現(xiàn)良好，定量下限為50ng/mL，批內(nèi)、批間精密度（以相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差表示）均小于15％，準(zhǔn)確度（以相對(duì)誤差表示）在15％以內(nèi)。
　　本論文的創(chuàng)新性以及取得的主要成果和結(jié)論:
　　1.首次考察了20 kDa直鏈和支鏈PEG定點(diǎn)修飾的HSA在大鼠失血性休克模型中作為血容量擴(kuò)充劑的療效，證實(shí)了高M(jìn)rPEG定點(diǎn)修飾的HSA作為血容量擴(kuò)充劑的優(yōu)勢(shì)，揭示了PEG的高黏性和高滲性分別有助于增加微血管的灌注和減

23、輕肺部缺血再灌注損傷，發(fā)現(xiàn)了支鏈PEG修飾對(duì)紅細(xì)胞的聚集性和變形性的影響，為PEG修飾劑構(gòu)型的選擇提供一定的理論基礎(chǔ)，同時(shí)也為PEG-HSA臨床應(yīng)用提供重要的參考依據(jù)。
　　2.首次采用小角中子散射技術(shù)研究了不同Mr和不同構(gòu)型的PEG修飾劑在HSA表面的空間取向和對(duì)蛋白結(jié)構(gòu)的影響，并首次采用SPR技術(shù)研究其對(duì)于臨近Cys34的血紅素結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合能力的影響，更好地從理論上解釋了PEG修飾賦予蛋白質(zhì)藥物在體內(nèi)的優(yōu)勢(shì)，例如分子半徑增加、

24、半衰期延長、免疫原性降低等，同時(shí)也為PEG修飾劑Mr、結(jié)構(gòu)和修飾位點(diǎn)的選擇優(yōu)化提供了新的研究方法。
　　3.首次采用NanoLC-MS/MS通過檢測(cè)PEG-HSA經(jīng)酶解后的肽段來測(cè)定完整的PEG-HSA在大鼠血漿中的濃度，建立了一種新的具有高靈敏度和高選擇性的定量方法，可以解決放射性同位素標(biāo)記不穩(wěn)定、易脫落以及難以反映藥物真實(shí)藥代動(dòng)力學(xué)情況的問題。此方法的專屬性良好，方法的準(zhǔn)確度、精密度、提取回收率、基質(zhì)效應(yīng)、穩(wěn)定性等都符合相關(guān)要