構(gòu)建和比較不同方法介導(dǎo)Gαi2C-terminal peptide轉(zhuǎn)染乳鼠心肌細(xì)胞去迷走神經(jīng)治療心房顫動的研究.pdf

1、目的:構(gòu)建攜帶Gαi2ctp的相關(guān)質(zhì)粒和病毒，通過比較電穿孔法、腺病毒轉(zhuǎn)染法和9型腺相關(guān)病毒轉(zhuǎn)染法轉(zhuǎn)染Giα2ctp基因至乳鼠心肌細(xì)胞，比較不同方法的轉(zhuǎn)染效率、心肌毒性以及對膽堿類藥物迷走效應(yīng)的拮抗作用，探尋Gαi2ctp基因功能表達(dá)的最適轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。
　　方法:構(gòu)建重組質(zhì)粒pDC316-Gαi2ctp-mCMV-EGFP、重組腺病毒rAd-Gαi2ctp-mCMV-EGFP和重組9型腺相關(guān)病毒rAVV9-Gαi2ctp-IRES-

2、EGFP以及相對應(yīng)未攜帶Gαi2ctp的對照組。三種方法轉(zhuǎn)染攜帶免疫熒光蛋白(EGFP)的Gi2ctp目的基因至乳鼠心肌細(xì)胞，分別找尋最佳電轉(zhuǎn)參數(shù)和病毒最佳感染復(fù)數(shù)(MOI);比較最佳參數(shù)下不同方法轉(zhuǎn)染情況和最大效率;AlamarBlue法測各時間點(diǎn)還原比率評估心肌毒性，western-blot法檢測Gαi2ctp蛋白表達(dá)情況。最后分別將Gαi2ctp基因組、無基因組和空白對照組，以最適濃度的卡巴膽堿干預(yù)各組細(xì)胞，通過計(jì)數(shù)細(xì)胞整體搏動頻

3、率比較三種方法下Gαi2ctp基因的抗迷走效應(yīng)差異。
　　結(jié)果:成功構(gòu)建攜帶Gαi2ctp的真核轉(zhuǎn)染質(zhì)粒、rAd和rAVV9。電穿孔最佳設(shè)置為:電壓:200V，脈沖時程:2ms，脈沖次數(shù):4次/分，脈沖間隔:60s，細(xì)胞濃度:1×106/ml，質(zhì)粒濃度:5ug/ml，電穿孔12h后細(xì)胞平均存活率為57.3％;rAd和rAVV9最佳MOI分別為250pfu/cell和1×107vg/cell。三種方法最佳參數(shù)下轉(zhuǎn)染效率分別為:質(zhì)粒組

4、:(54.2±4.8)％于2d、rAd組:100％于1.5d和rAVV9組（59.2±4.4）％于4d;第11d轉(zhuǎn)染效率分別為（30.1±6.6）％（12±3.4）％和（36±6.1）％;Western-blot法驗(yàn)證三組Gαi2ctp-EGFP蛋白成功表達(dá);rAVV9組在全觀察期11d內(nèi)細(xì)胞活性接近空白對照組(P＞0.05)，3d后電穿孔組和rAd組細(xì)胞活性開始明顯下降且后者較顯著（P＜0.05）?？ò湍憠A以最佳起效濃度1μmol·L

5、-1干預(yù)培養(yǎng)3d的各組細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)Gαi2ctp基因組較無基因組具有明顯的抗卡巴膽堿迷走效應(yīng)(P＜0.05)，但Gαi2ctp基因組間比較未見明顯差異（P＞0.05）。
　　結(jié)論:三種轉(zhuǎn)染方法皆可有效轉(zhuǎn)染乳鼠心肌細(xì)胞，但各自具有不同特點(diǎn):電穿孔法轉(zhuǎn)染迅速、轉(zhuǎn)染效率尚可，但對細(xì)胞具有較大的破壞力;rAd法轉(zhuǎn)染效率最高可達(dá)100％、但表達(dá)時間較短、心肌毒性較大;AVV9法轉(zhuǎn)染起效較慢但能夠穩(wěn)定長時間表達(dá)且生物安全性最好。三種方法皆可有效