鼠傷寒沙門菌pat-cobB缺失株的構(gòu)建及其應(yīng)對酸壓力的研究.pdf

1、作為腸道細菌，鼠傷寒沙門菌(Salmonella spp.)需要克服胃中酸性環(huán)境，才能進一步入侵宿主腸道上皮細胞。已有研究表明，沙門菌已經(jīng)進化出多種應(yīng)答機制，增強自身在酸性環(huán)境下的生存。對于沙門菌抗酸機制研究最多的是酸耐受應(yīng)答(Acid toleranceresponse，ATR)。ATR指經(jīng)過弱酸的適應(yīng)，在隨后的致死酸性條件下細菌存活能力增強的現(xiàn)象。因而，經(jīng)過ATR的沙門菌可以更好地抵御胃酸，增加入侵力以及毒力，導(dǎo)致人或其他宿主患病的

2、幾率升高[1]。
　　目前，兩個pH依賴的ATR已經(jīng)知道，即對數(shù)期ATR和平臺期ATR。在這兩個過程中都需要誘導(dǎo)合成多種酸激蛋白(Acid shock proteins，ASPs)，保護和修復(fù)在酸壓力下受到損傷的大分子，這些大分子分別在沙門菌的不同生長時期發(fā)揮著作用。同時沙門菌還具有賴氨酸和精氨酸兩種脫羧系統(tǒng)，該系統(tǒng)利用氨基酸轉(zhuǎn)運泵將胞內(nèi)的H+泵出體外，從而在強酸下維持胞內(nèi)pH相對穩(wěn)定。
　　原核生物的乙?；芯恐饕菍ι抽T

3、菌的研究。在沙門菌體內(nèi)，cobB負責(zé)編碼Sir2同源蛋白，行使去乙?；δ?pat編碼乙酰基轉(zhuǎn)移酶(YfiQ)，具有乙?；δ躘2]?；谏抽T菌中大量蛋白存在乙酰化修飾現(xiàn)象，而且乙?；揎梾⑴c細菌各種生理活動，我們推測乙?；?去乙?；揎椣到y(tǒng)可能參與了鼠傷寒沙門菌的酸耐受應(yīng)答。
　　因此，本研究首先采用λ-Red同源重組系統(tǒng)構(gòu)建了鼠傷寒沙門菌pat和cobB突變株，通過繪制生長曲線比較pat突變株、cobB突變株與野生株Salmo

4、nella entericaserovar Typhimurium14028s生長差異，利用Cfu計數(shù)法檢測三株菌對酸耐受應(yīng)答和抗酸的差異，Western blot檢測酸性培養(yǎng)條件和正常培養(yǎng)條件下Salmonella Typhimurium乙?；V的差異，以及三株菌胞內(nèi)pH的變化，最后通過實時熒光定量PCR技術(shù)在分子水平上檢測耐酸和抗酸的相關(guān)基因在三株菌中的轉(zhuǎn)錄變化。
　　實驗結(jié)果顯示，λ-Red同源重組系統(tǒng)可有效地用于沙門菌的基

5、因敲除。與野生株相比，pat或cobB突變的Salmonella Typhimurium生長情況無顯著差異，表明行使乙酰化/去乙?；δ艿膒atcobB的缺失并不會影響細菌的生長。通過將這三株菌放于弱酸條件下適應(yīng)，再放于強酸環(huán)境中，進行ATR，該三株菌無論在對數(shù)期還是平臺期，存活率均無差異，但是生長到平臺期的菌對外界逆境的抵抗能力明顯強于對數(shù)期的菌。上述結(jié)果說明，這對乙?；?去乙?；窹at/CobB在沙門菌的對數(shù)期以及平臺期酸耐受應(yīng)答

6、中均未發(fā)揮重要作用。但是pat的敲除會導(dǎo)致對數(shù)期沙門菌在抗酸實驗中存活率上升，cobB的敲除會導(dǎo)致平臺期沙門菌在抗酸實驗中存活率下降。Western blot技術(shù)檢測酸性環(huán)境的刺激并不能顯著改變沙門菌乙?；V，并且三個菌株在酸環(huán)境中的胞內(nèi)pH幾乎一致。隨后，我們采用實時熒光定量PCR技術(shù)，在分子水平上檢測了目前已知的幾個參與沙門菌耐酸和抗酸基因的轉(zhuǎn)錄情況，結(jié)果表明phoP在pat的敲除株中轉(zhuǎn)錄上升。
　　綜合上述實驗結(jié)果表明，乙酰