ATF6在家族性肌萎縮側(cè)索硬化模型hSOD1G93A轉(zhuǎn)基因小鼠脊髓中的表達(dá)變化.pdf

1、目的:肌萎縮側(cè)索硬化(Amyotrophic Lateral Sclerosis,ALS)是一種逐漸進(jìn)展的致命性的神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病。其病理特征表現(xiàn)為脊髓、運(yùn)動(dòng)皮層及腦干運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元丟失。臨床表現(xiàn)為肌肉的萎縮無力、癱瘓,逐漸喪失勞動(dòng)能力,呼吸肌麻痹,患者通常在發(fā)病3-5年內(nèi)死亡。目前ALS確切的病理機(jī)制仍然不清,該病90％～95％的患者沒有明顯的遺傳因素,即散發(fā)性ALS(sALS),其余5％～10％的患者屬于顯性遺傳病,也稱為家族型ALS

2、(fALS),后者中大約1/5患者中有銅/鋅過氧化物歧化酶(SOD1)的突變,表達(dá)人突變SOD1基因的轉(zhuǎn)基因小鼠臨床及病理表現(xiàn)與人ALS相似。
　　 多個(gè)研究證實(shí)家族性ALS中存在SOD1基因突變,突變位點(diǎn)幾乎跨越整個(gè)SOD1分子。多數(shù)為錯(cuò)義突變,引起表達(dá)蛋白中某個(gè)氨基酸的替換;少數(shù)為非錯(cuò)義突變---早期終止突變,導(dǎo)致翻譯后蛋白分子的一段序列缺失。錯(cuò)義突變中以外顯子中密碼子第4位丙氨酸(Ala)突變?yōu)槔i氨酸(Val),即A4V突

3、變,為最常見的突變位點(diǎn)。最初認(rèn)為,mSODl引起ALS的可能機(jī)制是mSOD1酶活性降低,導(dǎo)致自由基清除障礙,從而繼發(fā)氧化損傷運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元(motor neuron,MN),但是后續(xù)研究卻發(fā)現(xiàn)部分mSOD1保持一定甚至全部的酶活性。過表達(dá)野生型SOD1(wtSOD1)并不會(huì)減輕轉(zhuǎn)基因小鼠ALS的癥狀,甚至使癥狀惡化,同時(shí)敲除SOD1基因的小鼠并沒有出現(xiàn)明顯的ALS病狀,推測ALS的發(fā)生可能與mSOD1獲得性毒性作用有關(guān)。目前己建立了多種表達(dá)

4、人SOD1(hSOD1)突變的轉(zhuǎn)基因鼠模型,其中hSOD1G93A轉(zhuǎn)基因小鼠應(yīng)用最廣泛,是目前國際上公認(rèn)的ALS發(fā)病機(jī)制及臨床前藥物研究的動(dòng)物模型。
　　 最近ALS病理機(jī)制之一內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(ERS)逐漸受到關(guān)注,且已發(fā)現(xiàn)ALS的脊髓前角、大腦皮層及腦干運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元選擇性丟失大多數(shù)是由凋亡引起的。凋亡(apoptosis)又叫程序性細(xì)胞死亡,是指機(jī)體在生理?xiàng)l件下受到刺激后,經(jīng)過多種信號傳遞導(dǎo)致細(xì)胞產(chǎn)生一系列形態(tài)和生化方面的改變而引起

5、細(xì)胞自殺的過程。自1972年John Korr第一次提出凋亡概念后,經(jīng)三十幾年的研究目前已知有三條主要的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路來調(diào)控細(xì)胞凋亡:(1)線粒體通路;(2)死亡受體通路;(3)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)通路。
　　 當(dāng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)未折疊蛋白負(fù)荷嚴(yán)重超過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)折疊能力時(shí),就將導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)的未折疊蛋白聚集,從而導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激,其表現(xiàn)為未折疊蛋白反應(yīng)(unfolded porotein response UPR)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)降解(ERAD)和細(xì)胞凋亡。UP

6、R是由一個(gè)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分子伴侶GRP78/BIP和三個(gè)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激感受蛋白所介導(dǎo)的,三個(gè)感受蛋白分別是PERK(PKR-like ER kinase),ATF6(activating transcription factor6)和IRE-1(inositol-requiring enzyme1),當(dāng)發(fā)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激時(shí)引起GRP78/BIP與三個(gè)感受蛋白PREK、AFT6和IRE-1的分離,進(jìn)而激活PREK、ATF6和IRE-1三條信號通路。

7、>　　 ATF6(轉(zhuǎn)錄激活因子)為Ⅱ型跨膜蛋白,胞漿部分含有bZip轉(zhuǎn)錄因子結(jié)構(gòu)域和轉(zhuǎn)錄激活區(qū)域,其在非內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激狀態(tài)下,其內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔部分結(jié)合伴侶蛋白BIP,并以這種無活性狀態(tài)(P90ATF6)存在。活化后與BIP分離,并在高爾基體內(nèi)被S1P、S2P蛋白酶水解,形成p50ATF6的活化形式,轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞核內(nèi),活化后的ATF6可增加一系列目的基因的表達(dá),包括BIP、CHOP/GADD153、鈣網(wǎng)織蛋白和ERAD蛋白表達(dá)增加,同時(shí)也增加XBP

8、1的轉(zhuǎn)錄,并激活ERSE,最終引起運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元凋亡。
　　 最近研究表明在家族性肌萎縮側(cè)索硬化動(dòng)物模型hSOD1G93A小鼠的脊髓中存在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激引起的細(xì)胞凋亡。本文將初步研究hSOD1G93A小鼠的脊髓中是否存在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激中ATF6信號通路的激活,進(jìn)而探究內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激在ALS發(fā)病機(jī)制中的作用。
　　 方法:第一部分:hSOD1G93A轉(zhuǎn)基因小鼠及其同窩對照組小鼠的獲得:以B6SJL-Tg(SOD1G93A)1G

9、ur/J半合子雄鼠及B6SJLF1/J+/+雌鼠配種,提取小鼠尾尖DNA,進(jìn)行hSOD1G93A基因的PCR分析鑒定,鑒定出含hSOD1G93A轉(zhuǎn)基因的小鼠和不含hSOD1G93A基因的小鼠;將上述鑒定陽性的小鼠做為本實(shí)驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)組,鑒定陰性的小鼠做為對照組。第二部分:(1)實(shí)驗(yàn)分組無癥狀組hSOD1G93A轉(zhuǎn)基因小鼠3只(60天)、癥狀早期hSOD1G93A轉(zhuǎn)基因小鼠3只(約105-115天),終末期hSOD1G93A轉(zhuǎn)基因小鼠3只(約

10、120-130天),對照組為鑒定陰性的小鼠3只(120天)。(2)于各時(shí)間點(diǎn)用4％的水合氯醛腹腔注射麻醉小鼠,快速暴露心臟,經(jīng)4％多聚甲醛灌注固定心臟后,取出腰段脊髓,浸泡在4％多聚甲醛48小時(shí)后,震動(dòng)切片機(jī)連續(xù)切片,每片厚20μm,冰凍切片機(jī)連續(xù)切片,每片厚30μm。(3)免疫熒光化學(xué)染色冰凍切片經(jīng)0.01M PBS連續(xù)漂洗三次,各5分鐘,10％H2O2室溫中15分鐘,0.01M PBS;連續(xù)洗三次,各5分鐘,經(jīng)0.3％TritonX

11、-100打孔切片后,10％馬血清封閉1小時(shí),加入1:200 ATF6(SANTA CRUZ)兔多克隆抗體和1:1000 SMI32(美國Sigma公司)鼠多克隆抗體,4℃孵育搖床過夜;經(jīng)0.01M PBS連續(xù)漂洗三次,各5分鐘,避光加入1:200FITC和CY5熒光二抗,室溫?fù)u床1.5小時(shí),經(jīng)0.01M PBS連續(xù)漂洗三次,各5分鐘,熒光衰減淬滅劑封片,激光共聚焦顯微鏡觀察。(4)免疫組織化學(xué)染色震動(dòng)切片經(jīng)0.01M PBS連續(xù)漂洗三次

12、,各5分鐘,10％H2O2室溫中15分鐘,0.01M PBS;連續(xù)洗三次,各5分鐘,經(jīng)0.3％TritonX-100打孔切片后,10％馬血清封閉1小時(shí),加入1:200 ATF6(SANTA CRUZ)兔多克隆抗體,4℃孵育搖床過夜;經(jīng)0.01M PBS連續(xù)漂洗三次,各5分鐘,加入1:200生物素化山羊抗兔IgG,室溫?fù)u床2h;0.01M PBS連續(xù)漂洗三次,各5分鐘,加入1:200辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素室溫?fù)u床1h;DAB顯色15分鐘,蒸

13、餾水終止顯色,鋪片、常規(guī)脫水、明膠封片。統(tǒng)計(jì)分析:實(shí)驗(yàn)結(jié)果以均值±標(biāo)準(zhǔn)差((x)±s)表示,采用SPSS17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,四組比較采用非參數(shù)檢驗(yàn)分析,兩兩比較采用t檢驗(yàn),統(tǒng)計(jì)結(jié)果以P＜0.05為有顯著性差異。
　　 結(jié)果:1經(jīng)PCR將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分為hSOD1G93A轉(zhuǎn)基因小鼠和陰性小鼠。2癥狀早期和終末期較對照組和無癥狀組ATF6進(jìn)入細(xì)胞核的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元數(shù)量明顯增多,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;癥狀早期和終末期相比無明顯改變;對照組的A