肌萎縮側(cè)索硬化轉(zhuǎn)基因小鼠腦干及其運(yùn)動(dòng)核的自噬改變及二相酶表達(dá)變化研究.pdf

1、目的:肌萎縮側(cè)索硬化(AmyotrophicLateralSclerosis，ALS)是運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元疾病的一種亞型，是一種常見(jiàn)的致命的慢性進(jìn)行性中樞神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病，選擇性侵犯上、下運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元，一般不侵犯感覺(jué)系統(tǒng)，以脊髓、腦干和大腦選擇性的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元變性為特征，累及部位為大腦皮層運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元、脊髓前角運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元和腦干運(yùn)動(dòng)神經(jīng)核團(tuán)。起病緩慢，進(jìn)行性發(fā)展，表現(xiàn)為進(jìn)行性加重的肌肉萎縮無(wú)力、肌束震顫、喪失運(yùn)動(dòng)功能而癱瘓，肌張力增高、腱反射亢進(jìn)、病理

2、征陽(yáng)性，并出現(xiàn)構(gòu)音障礙、吞咽困難。因缺乏有效的治療，患者多在首發(fā)癥狀出現(xiàn)后的3-5年內(nèi)死于延髓麻痹或呼吸肌逐漸萎縮無(wú)力而引起的呼吸衰竭。根據(jù)其起病方式可分為兩類(lèi):5-10％的家族性ALS（fALS）和90-95％的散發(fā)性ALS(sALS)[1]。
　　 ALS癥狀的出現(xiàn)可發(fā)生在四肢的肌肉（脊髓發(fā)?。?，或者頭部和頸部（延髓發(fā)病）。大約25％病人在發(fā)病初期腦干運(yùn)動(dòng)核團(tuán)即受累，出現(xiàn)咽喉肌麻痹和舌肌萎縮，且病情嚴(yán)重、發(fā)展迅速，通常在診斷

3、1-2年內(nèi)因呼吸肌麻痹或繼發(fā)肺部感染而死亡[2]，而且?guī)缀跛胁±诩膊∵M(jìn)展過(guò)程中均表現(xiàn)出腦干受累癥狀[3]。臨床表現(xiàn)為構(gòu)音、吞咽、呼吸功能異常，嚴(yán)重影響生活質(zhì)量和生存期。初步確定腦干中三叉神經(jīng)核、面神經(jīng)核、疑核、舌下神經(jīng)核為受累核團(tuán)，眼球運(yùn)動(dòng)核團(tuán)為未受累核團(tuán)。
　　 目前關(guān)于選擇性運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元損害的假說(shuō)主要有:氧化應(yīng)激、線(xiàn)粒體功能障礙、蛋白質(zhì)錯(cuò)折疊及異常聚積、谷氨酸鹽興奮性中毒、自身免疫反應(yīng)等。但單一任何一種假說(shuō)都無(wú)法完全解釋A

4、LS的選擇性運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的損害，因此ALS的發(fā)病機(jī)制不可能是單一因素引起，而應(yīng)是多種因素共同作用的結(jié)果，但是這些因素之間的相互作用以及以哪些因素為主還不清楚。
　　 盡管在人類(lèi)ALS病例中腦干受累較普遍且表現(xiàn)嚴(yán)重，但相較脊髓和運(yùn)動(dòng)皮層來(lái)說(shuō)研究較少。所以，本實(shí)驗(yàn)用國(guó)際公認(rèn)的ALS動(dòng)物模型SOD1-G93A小鼠作為研究對(duì)象，研究不同時(shí)期小鼠腦干不同部位自噬和氧化應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)的變化，探討其在腦干運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元變性中的作用，為ALS治療提供新

5、的靶點(diǎn)。
　　 方法:
　　 1轉(zhuǎn)基因小鼠的繁殖
　　 SOD1-G93A轉(zhuǎn)基因小鼠在恒溫(25-27℃)、恒濕和無(wú)特定病原菌（Specificpathogenfree，SPF）環(huán)境中飼養(yǎng)，給予滅菌的SPF級(jí)顆粒型鼠類(lèi)飼料和無(wú)菌水。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)過(guò)程按照河北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理辦法規(guī)定實(shí)行。以B6SJLBTg(SOD1-G93A)1Gur/J半合子雄鼠與B6SJLF1/J雌鼠交配繁殖。兩種小鼠均購(gòu)自美國(guó)Jackson實(shí)驗(yàn)室(

6、BarHarbor,ME，USA)，最初由Gurney等研制。子代鼠在出生后三周左右取尾尖部組織提取DNA并經(jīng)PCR擴(kuò)增，鑒定是否攜帶有人突變SOD1基因。
　　 2轉(zhuǎn)基因小鼠運(yùn)動(dòng)功能評(píng)分及實(shí)驗(yàn)分組
　　 2.1運(yùn)動(dòng)功能評(píng)分
　　 從小鼠50天開(kāi)始每天進(jìn)行運(yùn)動(dòng)功能評(píng)分一次。分為五個(gè)階段。
　　 (1)無(wú)運(yùn)動(dòng)障礙，無(wú)體重減輕為4分;
　　 (2)懸尾時(shí)后肢震顫為3分;
　　 (3)步態(tài)異常為

7、2分;
　　 (4)至少一側(cè)后肢拖拽1分;
　　 (5)將小鼠仰或側(cè)臥，30秒內(nèi)不能翻正0分。
　　 2.2實(shí)驗(yàn)分組
　　 依據(jù)SOD1-G93A小鼠的發(fā)病規(guī)律在3個(gè)時(shí)間點(diǎn)取材，分別為癥狀前期（60天）、癥狀早期（100-120天）和終末期（130-150天）。癥狀前期體重?zé)o減輕且無(wú)臨床癥狀出現(xiàn)，評(píng)分為4分。癥狀早期指體重開(kāi)始減輕并出現(xiàn)步態(tài)異常，評(píng)分為2分。終末期體重減輕達(dá)20％以上且仰臥30秒不能翻身，

8、評(píng)分為0分。每個(gè)時(shí)期又設(shè)有模型組和同窩對(duì)照組。模型組為SOD1-G93A轉(zhuǎn)基因小鼠，對(duì)照組為非轉(zhuǎn)基因同窩對(duì)照小鼠，每組每個(gè)時(shí)期6只小鼠。
　　 3實(shí)驗(yàn)方法
　　 3.1取材
　　 各時(shí)期小鼠及同窩對(duì)照小鼠在相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)取材。用10％的水合氯醛(350mg/Kg)腹膜內(nèi)注射麻醉后，分別于4％多聚甲醛灌流固定保存或新鮮取腦干組織迅速投入液氮速凍后于-80℃冰箱保存。
　　 3.2免疫印跡法(Westernblo

9、tting)
　　 對(duì)中腦、腦橋和延髓分別提取總蛋白，BCA法測(cè)取蛋白濃度。每個(gè)樣品按60μg蛋白上樣，10％SDS-PAGE電泳后轉(zhuǎn)膜至PVDF膜，室溫脫脂奶粉(PBS稀釋)封閉1小時(shí)后，分別加兔抗P62抗體、羊抗SOD1抗體、兔抗LC3抗體、兔抗CD11b抗體、兔抗GFAP抗體、兔抗ACTIN抗體、鼠抗GAPDH抗體、兔抗HO-1抗體、羊抗NQO1抗體、兔抗GCLC抗體4℃置于搖床上過(guò)夜。次日，TPBS洗膜3次，PBS洗膜1

10、次，每次洗5分鐘。然后分別加相應(yīng)熒光二抗室溫孵育1小時(shí)，TPBS洗膜3次，PBS洗膜1次，每次洗5分鐘，使用Odyssey紅外掃描成像系統(tǒng)（美國(guó)LI-COR公司）掃膜后分析結(jié)果。計(jì)算目的條帶與ACTIN或GAPDH灰度的比值，最后進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。
　　 3.3免疫組織化學(xué)法
　　 腦干組織用4％多聚甲醛固定，使用LeicaVT1000S振動(dòng)切片機(jī)切成25μm厚的切片，0.01MPBS溶液漂洗3次，每次5分鐘;3％的H2O

11、2浸泡15分鐘，封閉內(nèi)源性過(guò)氧化物酶;0.01MPBS漂洗3次，每次5分鐘，0.3％的tritonX-100穿孔1次，15分鐘。10％的馬血清室溫封閉1小時(shí)后，分別加入鼠抗SMI-32抗體、鼠抗NeuN抗體、兔抗P62抗體、兔抗LC3抗體、兔抗Iba1抗體、兔抗GFAP抗體4℃搖床過(guò)夜;0.01MPBS洗3次，每次5分鐘后，分別加相應(yīng)二抗，室溫置于搖床上2小時(shí);0.01MPBS洗3次，每次5分鐘;加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的鏈霉卵白素室溫置

12、于搖床上1小時(shí);0.01MPBS洗3次，每次5分鐘后，DAB顯色10分鐘，撈片，脫水，透明及封片。OlympusBX51顯微鏡觀(guān)察及照相。
　　 3.4免疫熒光法
　　 與免疫組化方法相似，腦干組織經(jīng)4％多聚甲醛固定后，經(jīng)LeicaVT1000S振動(dòng)切片機(jī)切成30μm厚的切片，經(jīng)漂洗、穿孔、封閉、一抗、熒光二抗孵育，PBS漂洗后，抗熒光衰減封片劑封片，OlympusFV1000激光共聚焦顯微鏡觀(guān)察及照相。
　　

13、3.5統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
　　 采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理，采用多樣本參數(shù)方差分析。測(cè)定結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（(X)±s）表示，采用檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05，P＜0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)果:
　　 1轉(zhuǎn)基因小鼠的鑒定
　　 子代鼠基因組DNA的PCR產(chǎn)物電泳顯示:位于300-400bp之間有一條帶(324bp)，為內(nèi)參照IL-2的PCR產(chǎn)物;位于200-300bp之間的條帶(236bp)，

14、為突變SOD1基因的PCR產(chǎn)物。
　　 2運(yùn)動(dòng)功能變化
　　 在出生后60天以前SOD1-G93A小鼠無(wú)明顯運(yùn)動(dòng)功能變化，與對(duì)照組小鼠一樣，評(píng)分為4分。在80-90天左右，SOD1-G93A小鼠在懸尾實(shí)驗(yàn)時(shí)開(kāi)始出現(xiàn)雙后肢的震顫，評(píng)分為3分。在100-120天左右，一側(cè)或雙側(cè)后肢逐漸出現(xiàn)明顯的無(wú)力、肌肉萎縮以及步態(tài)異常，評(píng)分為2分。以后，隨著病情的進(jìn)展，雙后肢出現(xiàn)進(jìn)行性的肌肉萎縮，并不能支撐身體，至少一側(cè)后肢出現(xiàn)完全性癱瘓

15、，行走時(shí)出現(xiàn)拖拽現(xiàn)象，評(píng)分為1分。大約在130-150天左右，SOD1-G93A小鼠的四肢均受累，使其仰臥，30秒內(nèi)不能自行翻轉(zhuǎn)，體重降低超過(guò)20％，達(dá)到終末期，評(píng)分為0分。同窩對(duì)照組小鼠不出現(xiàn)上述情況，表現(xiàn)活躍，評(píng)分始終為4分。
　　 3SOD1-G93A轉(zhuǎn)基因小鼠終末期腦干舌下神經(jīng)核、面神經(jīng)核、紅核運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元明顯減少，且存在顯著的星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞增生;GFAP和CD11b蛋白表達(dá)量隨病程進(jìn)展進(jìn)行性增多，終末期達(dá)高峰(

16、P＜0.05)。動(dòng)眼神經(jīng)核無(wú)明顯神經(jīng)元丟失及膠質(zhì)增生。
　　 4肌萎縮側(cè)索硬化轉(zhuǎn)基因小鼠腦干及其運(yùn)動(dòng)核存在自噬通路異常
　　 4.1免疫印跡法研究發(fā)現(xiàn)，SOD1-G93A轉(zhuǎn)基因小鼠腦干不同部位包括中腦、橋腦及延髓中P62、突變SOD1和LC3Ⅱ表達(dá)隨病程進(jìn)展進(jìn)行性增多，終末期達(dá)高峰(P＜0.05)，各時(shí)期中腦、腦橋、延髓之間無(wú)明顯差異。
　　 4.2免疫組化法研究發(fā)現(xiàn)SOD1-G93A轉(zhuǎn)基因小鼠腦干中舌下神經(jīng)核、

17、面神經(jīng)核和紅核部位可見(jiàn)大量P62聚集體形成，殘存神經(jīng)元呈P62和LC3強(qiáng)陽(yáng)性，動(dòng)眼神經(jīng)核P62和LC3表達(dá)與非轉(zhuǎn)基因?qū)φ招∈笙啾葻o(wú)明顯差別。
　　 4.3免疫熒光法研究發(fā)現(xiàn)SOD1-G93A轉(zhuǎn)基因小鼠腦干舌下神經(jīng)核、面神經(jīng)核和紅核中殘存神經(jīng)元高表達(dá)突變SOD1蛋白，且突變SOD1與GFAP陽(yáng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞間存在共定位;聚集的P62蛋白主要表達(dá)于殘存神經(jīng)元及其突起，而與GFAP陽(yáng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞間不存在共定位;LC3表達(dá)呈彌漫性增強(qiáng)

18、。動(dòng)眼神經(jīng)核P62和LC3表達(dá)與非轉(zhuǎn)基因?qū)φ招∈笙啾葻o(wú)明顯差別。
　　 5肌萎縮側(cè)索硬化轉(zhuǎn)基因小鼠腦干及其運(yùn)動(dòng)核的二相酶表達(dá)上調(diào)
　　 免疫印跡法研究發(fā)現(xiàn)終末期SOD1-G93A轉(zhuǎn)基因小鼠腦干不同部位HO-1、NQO1和GCLC表達(dá)明顯增多(P＜0.05)，且中腦、腦橋、延髓之間無(wú)明顯差異。HO-1表達(dá)在腦干各部位均隨病程進(jìn)展進(jìn)行性增多。
　　 結(jié)論:SOD1-G93A小鼠是研究肌萎縮側(cè)索硬化延髓麻痹的理想動(dòng)物模

19、型，腦干中舌下神經(jīng)核、面神經(jīng)核、紅核為受累核團(tuán)，動(dòng)眼神經(jīng)核為未受累核團(tuán)。在SOD1-G93A轉(zhuǎn)基因小鼠的中腦、腦橋和延髓，存在突變SOD1聚集，神經(jīng)元變性減少，星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞增生;自噬底物P62聚集和自噬體標(biāo)記物L(fēng)C3Ⅱ增多;氧化應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)HO-1、NQO1和GCLC表達(dá)增多。與以往在腰髓的研究相一致，說(shuō)明ALS的腦干受累與腰髓受累有相同的機(jī)制，均存在自噬通路異常和氧化應(yīng)激。但具體到不同的腦干核團(tuán)，受累情況不一，可能是由于不