丁基苯酞治療與預(yù)防肌萎縮側(cè)索硬化SOD1-G93A轉(zhuǎn)基因小鼠的實(shí)驗(yàn)研究正常人外周靜脈血SOD1蛋白表達(dá)水平的檢測(cè).pdf

1、第一部分:丁基苯酞治療與預(yù)防肌萎縮側(cè)索硬化SOD1-G93A轉(zhuǎn)基因小鼠的實(shí)驗(yàn)研究
　　 肌萎縮側(cè)索硬化(amyotrophic lateral sclerosis,ALS)是一種選擇性的累及上、下運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的致死性的神經(jīng)變性疾病。該病好發(fā)于成年人,起病隱襲,逐漸進(jìn)展,平均生存期約為3.5年。ALS的發(fā)病機(jī)制尚不明確,可能與以下幾個(gè)因素有關(guān):①銅鋅超氧化物岐化酶(Cu/Zn SOD,SOD1)基因突變；②谷氨酸的興奮毒作用；③線粒

2、體功能異常；④氧化應(yīng)激；⑤炎癥反應(yīng)；⑥凋亡；⑦非運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的參與等。對(duì)ALS發(fā)病機(jī)制和治療方法的探討一直是神經(jīng)科領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。氧化應(yīng)激和炎癥被認(rèn)為是ALS發(fā)病的主要機(jī)制。目前.ALS尚無(wú)有效治療方法。丁基苯酞(DL-3-n-butylphathlide,DL-NBP)是中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所研制開(kāi)發(fā)第一個(gè)具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的抗腦缺血一類新藥,目前已經(jīng)廣泛的應(yīng)用于臨床。研究結(jié)果顯示丁基苯酞可能通過(guò)減少氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)、抑制神經(jīng)元凋亡、

3、改善線粒體功能等作用機(jī)制,對(duì)腦缺血性所致中樞神經(jīng)功能的損傷起到改善作用。既往丁基苯酞的研究主要集中在急慢性腦缺血,對(duì)于ALS的研究未見(jiàn)報(bào)道。
　　 目的:
　　 本研究中,我們采用ALS轉(zhuǎn)基因小鼠模型,觀察丁基苯酞對(duì)小鼠生存期和運(yùn)動(dòng)功能障礙的改善作用,并對(duì)其作用機(jī)制進(jìn)行初步的探討。為開(kāi)發(fā)丁基苯酞成為治療ALS的藥物提供理論依據(jù)。
　　 方法:
　　 本實(shí)驗(yàn)以ALS-SOD1G93A轉(zhuǎn)基因小鼠為實(shí)驗(yàn)對(duì)象,應(yīng)

4、用Jackson實(shí)驗(yàn)室提供的引物和方案進(jìn)行PCR鑒定ALS-SOD1G93A轉(zhuǎn)基因小鼠。觀察ALS-SOD1G93A轉(zhuǎn)基因小鼠的表型特征；聯(lián)合應(yīng)用懸尾試驗(yàn)、稱重、轉(zhuǎn)棒實(shí)驗(yàn)和懸線實(shí)驗(yàn),來(lái)觀察ALS-SOD1G93A轉(zhuǎn)基因小鼠的發(fā)病時(shí)間和生存期。測(cè)定ALS-SOD1G93A轉(zhuǎn)基因小鼠腓腸肌復(fù)合肌肉動(dòng)作電位(compound muscle action potential,CMAP),應(yīng)用統(tǒng)計(jì)法運(yùn)動(dòng)單位數(shù)目計(jì)數(shù)(motor unit numb

5、er estimation,NUNE)觀察腓腸肌運(yùn)動(dòng)單位的數(shù)目。焦油紫尼氏染色計(jì)數(shù)ALS-SOD1G93A轉(zhuǎn)基因小鼠腰段脊髓前角的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元。免疫熒光染色觀察ALS-SOD1G93A轉(zhuǎn)基因小鼠脊髓前角小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞的激活以及cleaved Caspase-3蛋白的表達(dá)。HE染色觀察ALS-SOD1G93A轉(zhuǎn)基因小鼠腓腸肌的形態(tài)變化,Luxol fast blue中性紅髓鞘染色觀察小鼠坐骨神經(jīng)形態(tài)的改變。通過(guò)Western bl

6、otting方法分析了ALS-SOD1G93A轉(zhuǎn)基因小鼠脊髓核因子-E2相關(guān)因子2(Nuclear factor-erythroid2 related factor2,Nrf2)、核因子-κB(Nuclearfactor-kappa B,NF-κB)、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factors-α,TNF-α)、細(xì)胞色素c(cytochrome—c)、Bcl-2和Bax蛋白表達(dá)。
　　 結(jié)果:
　　

7、丁基苯酞60mg/kg治療組ALS-SOD1G93A轉(zhuǎn)基因小鼠的生存期為164.78±16.672天,而溶劑對(duì)照小鼠的平均生存期140.00±16.892天,丁基苯酞60mg/kg治療組小鼠的生存期延長(zhǎng)了24天(P<0.05)。丁基苯酞60mg/kg預(yù)防給藥使得ALS-SOD1G93A轉(zhuǎn)基因小鼠的生存期由158.40±7.436天,延長(zhǎng)到177.20±15.881天(P<0.05),發(fā)病時(shí)間延緩了10天(P<0.05)。丁基苯酞60mg

8、/kg治療能夠明顯延緩ALS-SOD1G93A轉(zhuǎn)基因小鼠的體重丟失(P<0.05),使小鼠的轉(zhuǎn)棒實(shí)驗(yàn)和懸線實(shí)驗(yàn)功能的損傷速度減緩(P<0.05)。丁基苯酞30mg/kg和120mg/kg治療給藥沒(méi)有看到顯著作用。與溶劑對(duì)照組(12.8±7.15 mv)相比,60mg/kg丁基苯酞治療給藥能增加腓腸肌CMAP的波幅(18.2±7.27mv),但沒(méi)有達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.209)。溶劑對(duì)照組ALS-SOD1G93A轉(zhuǎn)基因小鼠20周齡腓腸肌

9、MUNE是(63.2±31.87)個(gè),60mg/kg丁基苯酞治療給藥能延緩腓腸肌MUNE(110.5±9.68個(gè))減少的速度(P<0.05)。尼氏染色觀察到20周齡溶劑對(duì)照組小鼠脊髓前角運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元數(shù)是(9.5±2.92),丁基苯酞60mg/kg能夠明顯減輕ALS-SOD1G93A轉(zhuǎn)基因小鼠腰段脊髓前角運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的丟失(16.8±2.64,p<0.01)。免疫熒光染色發(fā)現(xiàn)溶劑對(duì)照組ALS-SOD1G93A轉(zhuǎn)基因小鼠腰髓小膠質(zhì)細(xì)胞CD11b

10、和星形膠質(zhì)細(xì)胞神經(jīng)膠質(zhì)酸性蛋白(Glial fibfillary acidprotein,GFAP)免疫陽(yáng)性明顯增強(qiáng),胞體明顯增大,提示為激活狀態(tài)的膠質(zhì)細(xì)胞,丁基苯酞60mg/kg則顯著抑制小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞的激活。同時(shí)免疫熒光染色提示ALS—SOD1G93A轉(zhuǎn)基因小鼠腰段脊髓cleaved Caspase-3的表達(dá)是增加的,丁基苯酞60mg/kg組小鼠脊髓cleaved Caspase-3的免疫陽(yáng)性明顯降低。Western bl

11、otting分析提示丁基苯酞60mg/kg明顯抑制ALS-SOD1G93A轉(zhuǎn)基因小鼠脊髓NF—κBp65和TNF-α的表達(dá),輕度上調(diào)Nrf2的表達(dá)。丁基苯酞還抑制Bax和cytochrome-c蛋白的表達(dá),上調(diào)Bcl-2的表達(dá)。
　　 結(jié)論:
　　 1丁基苯酞能延緩ALS-SOD1G93A轉(zhuǎn)基因小鼠的發(fā)病,顯著延長(zhǎng)生存期,延緩運(yùn)動(dòng)功能減退:
　　 2丁基苯酞能減慢ALS—SOD1G93A轉(zhuǎn)基因小鼠腓腸肌運(yùn)動(dòng)單位數(shù)

12、目的降低；
　　 3丁基苯酞能減慢ALS-SOD1G93A轉(zhuǎn)基因小鼠脊髓前角運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的丟失；
　　 4丁基苯酞能抑制ALS-SOD1G93A轉(zhuǎn)基因小鼠脊髓前角膠質(zhì)細(xì)胞的激活；
　　 5丁基苯酞可能通過(guò)抗炎癥和抗凋亡的作用對(duì)ALS-SOD1G93A轉(zhuǎn)基因小鼠產(chǎn)生一定的神經(jīng)保護(hù)作用。
　　 6丁基苯酞對(duì)ALS-SOD1G93A轉(zhuǎn)基因小鼠有一定的治療作用和預(yù)防作用。
　　 第二部分:正常人外周靜脈血S

13、OD1蛋白表達(dá)水平的檢測(cè)
　　 超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)是一類廣泛存在于生物體內(nèi)的金屬酶,是生物體內(nèi)一種重要的氧自由基清除劑,其作用可以特異性地催化氧自由基發(fā)生歧化反應(yīng),清除有毒性作用的自由基,使其產(chǎn)生和清除處于動(dòng)態(tài)平衡之中。肌萎縮側(cè)索硬化(amyotrophic lateral sclerosis,ALS)是一種致死性的神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病。目前發(fā)現(xiàn)ALS患者中SOD1基因突變已經(jīng)達(dá)到15

14、0多種。研究證實(shí)ALS是突變的SOD1“獲得性毒性功能”而并不是SOD1活性改變的發(fā)病機(jī)制。近來(lái)研究發(fā)現(xiàn)在阿爾茨海默病(Alzheimer disease,AD)和帕金森病(Parkinson disease,PD)患者腦組織中總的和氧化的SOD1水平均明顯增高,提示了SOD1參與了AD和PD的氧化應(yīng)激損傷過(guò)程。研究SOD1在神經(jīng)變性病中的表達(dá)對(duì)該類疾病發(fā)病機(jī)制的探討具有重要的價(jià)值。然而SOD1在正常人體內(nèi)的表達(dá)情況如何,目前未見(jiàn)有相關(guān)

15、報(bào)導(dǎo)。
　　 目的:
　　 本實(shí)驗(yàn)收集了正常人外周靜脈血,觀察不同年齡段正常人靜脈血的SOD1表達(dá)水平,為后續(xù)研究神經(jīng)變性病尤其是ALS患者體內(nèi)的SOD1表達(dá)做出前期的方法探索和數(shù)據(jù)積累。
　　 方法:
　　 隨機(jī)抽取北京協(xié)和醫(yī)院體檢中心正常健康人血樣120人份,收集一個(gè)ALS家系中正常成員(目前無(wú)ALS臨床癥狀)血樣10份,年齡范圍8個(gè)月至78歲。每位受檢者分別收集抗凝的檢驗(yàn)用全血約1000μl,血清約

16、50μl。采用Western blotting的方法檢測(cè)SOD1蛋白的表達(dá),黃嘌呤氧化酶法檢測(cè)SOD活性水平。
　　 結(jié)果:
　　 隨著年齡的增加,外周靜脈血單核細(xì)胞中SOD1蛋白表達(dá)水平是增加的,40-50歲左右SOD1蛋白水平達(dá)高峰,此后逐漸下降。正常人出生后總SOD活性呈下降的趨勢(shì),至20歲之前,血清中總SOD活性處于相對(duì)高的水平0.13-0.16U/ml,20歲左右后,總SOD活性明顯下降,隨著年齡的增加,稍有波