肌萎縮側索硬化脊髓器官型培養(yǎng)模型的研究.pdf

1、河北醫(yī)科大學博士學位論文肌萎縮側索硬化脊髓器官型培養(yǎng)模型的研究姓名：王曉娟申請學位級別：博士專業(yè)：神經(jīng)病學指導教師：李春巖20040401中文摘要形態(tài)，較單細胞培養(yǎng)更適于研究脊髓病變。我們利用脊髓器官型培養(yǎng)技術，結合谷氨酸興奮毒機制，慢性阻抑培養(yǎng)脊髓片的谷氨酸轉(zhuǎn)運，可以制備ALS的體外培養(yǎng)模型，進一步探討選擇性運動神經(jīng)元損傷的部分機制。課題研究分三部分：第一部分建立脊髓片器官型培養(yǎng)方法，并將培養(yǎng)的脊髓片與體內(nèi)發(fā)育至同時期的脊髓做比較；第

2、二部分依據(jù)谷氨酸興奮毒機制，應用適當濃度的谷氨酸轉(zhuǎn)運體抑制劑蘇羥天冬氨酸抑制谷氨酸轉(zhuǎn)運，使細胞外谷氨酸堆積對運動神經(jīng)元造成損傷而感覺神經(jīng)元不受影響，建立ALS的體外培養(yǎng)模型。第三部分利用體外培養(yǎng)模型觀察ALS患者血清對脊髓運動神經(jīng)元的影響，探討其選擇性運動神經(jīng)元損傷的部分機制。一、脊髓薄片器官型培養(yǎng)的方法研究目的：研究脊髓薄片器官型培養(yǎng)的方法并對脊髓腹角Ⅱ運動神經(jīng)元和背角中間神經(jīng)元進行鑒別，建立穩(wěn)定的脊髓體外培養(yǎng)模型。觀察體外大鼠器官型

3、培養(yǎng)的脊髓薄片是否與同齡大鼠體內(nèi)生長的脊髓具有相似的形態(tài)和恒定的腹角Q運動神經(jīng)元數(shù)目，建立能模擬體內(nèi)生長環(huán)境的穩(wěn)定的體外脊髓器官型培養(yǎng)模型。方法：脊髓器官型培養(yǎng)采用8日齡SD大鼠的腰段脊髓，在無菌條件下快速分離、取出整條脊髓，解剖顯微鏡下分離并剪斷腰段脊髓的神經(jīng)根，用MCIL組織切片機切成35011m厚的薄片，將腰段脊髓的切片轉(zhuǎn)移到GBSS中，在室溫下仔細分離成單片，6孔培養(yǎng)板內(nèi)每孔放入lml培養(yǎng)基MS，并放置Milliporeinse

4、rt，將完好的脊髓片轉(zhuǎn)移至insert上，每個insert上放5片，入C02培養(yǎng)箱(37℃，5％C0295％空氣)，每周換液2次。測定各時點培養(yǎng)液中乳酸脫氫酶(LDH)的含量。用神經(jīng)元的特異性免疫組化染色SMI32對脊髓腹角Ⅱ運動神經(jīng)元加以鑒定并與同齡大鼠體內(nèi)生長的脊髓做比較，用抗Calretinin單克隆抗體對脊髓片背角的中間神經(jīng)元進行鑒別。結果：脊髓片在體外生長良好，形態(tài)完整，培養(yǎng)存活率高，達90％以上；存活時間長，可達2個月以上。