家族性肌萎縮側(cè)索硬化模型中泛素與SOD1蛋白的相關(guān)性研究.pdf

1、目的:肌萎縮側(cè)索硬化(Amyotrophic Lateral Sclerosis,ALS)是最為常見(jiàn)的成人發(fā)病的神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病之一,人群發(fā)病率不到十萬(wàn)分之五。ALS以選擇性損害脊髓前角、腦干和大腦皮層運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元為特征,臨床表現(xiàn)為進(jìn)行性出現(xiàn)四肢肌肉的無(wú)力、萎縮、肌束震顫,并有肌張力增高、腱反射亢進(jìn)、病理征陽(yáng)性以及構(gòu)音障礙,最終因呼吸衰竭而死亡,病人存活期為3-5年。根據(jù)其發(fā)病和遺傳特點(diǎn)可分為家族性肌萎縮側(cè)索硬化(Familial Amy

2、otrophic Lateral Sclerosis,FALS)和散發(fā)性肌萎縮側(cè)索硬化(Sporadic Amyotrophic Imteral Sclerosis,SALS),其中FALS不足10％,而SALS則占整體ALS的90％以上。目前ALS的發(fā)病機(jī)制尚不清楚,但FALS中有大約20％是由于編碼Cu/Zn超氧化物歧化酶(SOD1)的基因突變引起,其突變位點(diǎn)在21號(hào)染色體長(zhǎng)臂Cu/Zn SOD基因內(nèi),即21q22.1-22.2。研

3、究認(rèn)為在家族性肌萎縮側(cè)索硬化患者和轉(zhuǎn)基因鼠中,突變SODl發(fā)生了錯(cuò)誤折疊,使其不能被泛素.蛋白酶體系統(tǒng)降解,導(dǎo)致在胞漿內(nèi)聚集,形成SOD1陽(yáng)性包涵體,而異常聚集的SOD1又具有了獲得性毒性,從而影響運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的功能,導(dǎo)致疾病的發(fā)生;神經(jīng)元內(nèi)的泛素陽(yáng)性包涵體被公認(rèn)為是肌萎縮側(cè)索硬化的病理學(xué)標(biāo)志,運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元中泛素化聚集物的形成與積累參與了突變SOD1毒性功能的獲得。泛素-蛋白酶體系統(tǒng)(ubiquitin-proteasome system,

4、UPS)在降解突變蛋白的過(guò)程中起到重要作用,而底物蛋白泛素化則是UPS的啟動(dòng)信號(hào)。本研究旨在應(yīng)用經(jīng)典家族性肌萎縮側(cè)索硬化模型SOD1G93A轉(zhuǎn)基因小鼠,在底物蛋白泛素化這一水平定性研究泛素與SOD1蛋白發(fā)病過(guò)程中相互作用方式,從而揭示突變SOD1蛋白的泛素化過(guò)程能否正常進(jìn)行。
　　 方法:實(shí)驗(yàn)動(dòng)物采用經(jīng)典家族性肌萎縮側(cè)索硬化模型SOD1G93A轉(zhuǎn)基因小鼠,并對(duì)其基因進(jìn)行鑒定,陽(yáng)性者即為SOD1G93A轉(zhuǎn)基因鼠,陰性者作為同窩對(duì)照

5、。實(shí)驗(yàn)分為三組:癥狀前期組、癥狀期組和終末期組,每組均設(shè)相應(yīng)的同窩對(duì)照;各個(gè)時(shí)期每組取6只小鼠。實(shí)驗(yàn)技術(shù)采用蛋白質(zhì)免疫印跡、激光共聚焦顯微鏡和免疫共沉淀的方法,分別觀察小鼠腰膨大組織中SOD1蛋白的表達(dá)以及泛素與SOD1兩種蛋白在SOD1G93A轉(zhuǎn)基因小鼠癥狀前期、癥狀期、終末期及其同窩對(duì)照腰膨大組織中的分布、共定位以及相互結(jié)合情況。
　　 結(jié)果:
　　 1、蛋白質(zhì)免疫印跡(Western blot)檢測(cè)顯示:
　

6、　 SOD1G93A轉(zhuǎn)基因小鼠的腰膨大組織中有兩條SOD1條帶,分子量小的條帶為小鼠自身攜帶的SOD1(21KD),另一分子量較大的條帶為轉(zhuǎn)人突變SOD1(23KD);而同窩對(duì)照組則只含有小鼠自身攜帶的內(nèi)源性SOD1一條帶。
　　 2、激光共聚焦顯微鏡發(fā)現(xiàn):
　　 對(duì)照組:可見(jiàn)正常形態(tài)及數(shù)量的脊髓前角運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元,泛素與SOD1蛋白在胞漿內(nèi)廣泛、均勻分布,并且二者存在廣泛的共定位;癥狀前期:脊髓前角的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元數(shù)量多,泛

7、素與SOD1蛋白在胞漿內(nèi)的含量豐富、分布均勻,并且二者亦廣泛的共定位;癥狀期:運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元數(shù)量較癥狀前期有所減少,泛素與SOD1在胞漿內(nèi)廣泛共定位的背景上還可見(jiàn)點(diǎn)狀聚集物,二者在聚集物中亦存在共定位的融合像;終末期:脊髓前角的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元數(shù)目顯著減少,細(xì)胞的基本形態(tài)消失,泛素與SOD1在脊髓前角內(nèi)形成點(diǎn)狀、片狀、不規(guī)則狀的聚集物,聚集物中可見(jiàn)二者共定位的融合像。
　　 3、免疫共沉淀觀察結(jié)果:
　　 在各組樣品中都檢測(cè)到了梯