重組泛素連接酶對(duì)肺癌靶向治療的初步探討.pdf

1、肺癌是目前全世界最常見(jiàn)的惡性腫瘤，其死亡率居世界首位。非小細(xì)胞肺癌是肺癌中最常見(jiàn)的一類，多數(shù)非小細(xì)胞肺癌的細(xì)胞中均有表皮生長(zhǎng)因子受體（EGFR）和該家族別的成員表達(dá)。EGFR是跨膜受體型酪氨酸激酶家族的一員，EGFR家族（ErbB家族）主要有四名成員，在肺癌的發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮重要的作用，目前以EGFR為治療靶點(diǎn)的靶向治療取得了令人鼓舞的成就。小分子EGFR受體型酪氨酸激酶抑制劑（TKI）如厄洛替尼和吉非替尼已開(kāi)展了較為深入的臨床試驗(yàn)。這

2、兩種藥物對(duì)10％-20%的非小細(xì)胞肺癌患者有較為明確的治療效果。但是，臨床結(jié)果證實(shí)，多數(shù)患者在治療一段時(shí)間后出現(xiàn)耐藥。目前認(rèn)為腫瘤細(xì)胞能通過(guò)多種單獨(dú)或者聯(lián)合的途徑獲得耐藥的能力，現(xiàn)階段比較公認(rèn)的機(jī)制主要有：EGFR基因獲得性二次突變，MET基因異常高擴(kuò)增以及 HGF異常高表達(dá)等。目前腫瘤耐藥已經(jīng)成為腫瘤治療中最大的障礙，對(duì)腫瘤聯(lián)合用藥有非常好的治療前景，我們期望能探索一種安全有效地治療方法，以提高腫瘤治療的效率。既然EGFR及其家族成員

3、對(duì)肺癌的發(fā)生和發(fā)展十分重要，我們希望有更多的新的方式來(lái)干預(yù)這些靶點(diǎn)。理論上，只要設(shè)計(jì)合理，我們能通過(guò)泛素化作用降解任意的蛋白質(zhì)，從而為腫瘤治療提供新的思路。泛素化最早被描述成為細(xì)胞內(nèi)清除短效的，受損的或者異常的蛋白的一種方式。然而，隨著當(dāng)今研究的進(jìn)展，越來(lái)越多的發(fā)現(xiàn)證實(shí)泛素化參與細(xì)胞內(nèi)更多的活動(dòng)，其地位與磷酸化越來(lái)越相近。泛素化的過(guò)程就是泛素激活酶E1將活化的泛素分子轉(zhuǎn)移到E2結(jié)合酶上，之后，泛素連接酶E3結(jié)合攜帶著泛素分子的泛素結(jié)合酶

4、E2，通過(guò)連接酶E3的轉(zhuǎn)移作用，泛素分子被轉(zhuǎn)移到底物蛋白上，這整個(gè)過(guò)程就是泛素化修飾。最后經(jīng)過(guò)泛素化修飾的蛋白質(zhì)被運(yùn)送到蛋白酶體，并被降解的過(guò)程。本研究通過(guò)構(gòu)建能夠靶向性識(shí)別和結(jié)合EGFR及其家族成員的受體型酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)域的重組泛素連接酶，利用具有泛素連接酶E3活性的Cbl的RING結(jié)構(gòu)域和CHIP的U-box結(jié)構(gòu)域行使泛素化、降解功能，通過(guò)泛素化作用，下調(diào)腫瘤細(xì)胞中EGFR的水平，最終實(shí)現(xiàn)抑制腫瘤的目的。這與傳統(tǒng)的靶向治療策略相比，

5、此方法具有能夠同時(shí)針對(duì)幾個(gè)具有相同結(jié)合結(jié)構(gòu)域的靶蛋白并直接降低其蛋白質(zhì)水平的優(yōu)勢(shì)，同時(shí)泛素化能夠有效避免靶蛋白發(fā)生繼發(fā)突變而導(dǎo)致耐藥。在利用泛素化靶向治療肺癌的同時(shí)，我們期望能利用此種技術(shù)為肺癌患者提供更多的益處。晚期肺癌患者，一旦出現(xiàn)肺癌骨轉(zhuǎn)移以后，疾病基本沒(méi)有治愈的機(jī)會(huì)，為了提高患者生活質(zhì)量，我們期望能用泛素化技術(shù)抑制轉(zhuǎn)移瘤對(duì)骨的破壞。轉(zhuǎn)移瘤對(duì)骨的溶骨性破壞一般由破骨細(xì)胞活性增強(qiáng)引起，而不是腫瘤細(xì)胞直接多骨組織的作用。在破骨細(xì)胞的活

6、化過(guò)程中，RANKL-OPG-RANK信號(hào)通路發(fā)揮著關(guān)鍵的作用。在此信號(hào)通路中，RANKL有著共同的接頭蛋白—TRAF家族蛋白，TRAF家族多個(gè)成員均以與TRIP(TRAF-interacting protein)結(jié)合。我們計(jì)劃利用能與TRAF蛋白靶向結(jié)合的TRIP C端的coiled-coiled結(jié)構(gòu)域構(gòu)建泛素重組連接酶，靶向降解TRAF家族蛋白，從而抑制破骨細(xì)胞的活性，最終達(dá)到抑制骨破壞的作用，提高患者的生活質(zhì)量。
　　在本研

7、究的第一部分實(shí)驗(yàn)中，我們通過(guò)重組PCR，將接頭分子Shc、Grb2分別能夠與磷酸化的EGFR結(jié)合的PTB結(jié)構(gòu)域（Phosphotyrosine Binding domain）和SH2（Src-homology region 2）結(jié)構(gòu)域的基因以及TRIP C端的coiled-coiled結(jié)構(gòu)域與CHIP的U-box結(jié)構(gòu)域基因或者Cbl的RING（Y371E）結(jié)構(gòu)域基因進(jìn)行基因融合，將構(gòu)建好的融合基因連接到真核表達(dá)載體pFLAG-CMV4里

8、，構(gòu)建具有目的特異性的重組泛素連接酶。接下來(lái)，在實(shí)驗(yàn)二中，我們首先篩選了最適宜的肺癌細(xì)胞系，并且檢測(cè)了重組泛素連接酶在肺癌細(xì)胞系和293T細(xì)胞系中對(duì)靶蛋白的降解作用。在第三部分實(shí)驗(yàn)中，我們從功能角度檢測(cè)了重組泛素連接酶對(duì)Spc-A1細(xì)胞系的惡性表性的影響。在實(shí)驗(yàn)四中，我們初步探討了重組泛素連接酶對(duì)與肺癌骨轉(zhuǎn)移的保護(hù)作用及其機(jī)制。
　　實(shí)驗(yàn)一：設(shè)計(jì)引物，利用普通PCR分別擴(kuò)增Shc的PTB結(jié)構(gòu)域基因、Grb2的SH2結(jié)構(gòu)域基因以及T

9、RIP C端的coiled-coiled結(jié)構(gòu)域、CHIP的U-box結(jié)構(gòu)域基因和點(diǎn)突變Cbl的RING（Y371E）結(jié)構(gòu)域基因，利用重組PCR將SH2、PTB以及TRIP與U-box、PTB與RING（Y371E）分別進(jìn)行基因融合，獲得的產(chǎn)物分別命名為SH2- RING（Y371E）、SH2-U-box和PTB-U-box以及 TRIP-U-box。將融合基因產(chǎn)物雙酶切處理，插入真核表達(dá)載體pFLAG-CMV4。經(jīng)過(guò)酶切鑒定和測(cè)序驗(yàn)證，

10、重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。
　　實(shí)驗(yàn)二：首先從腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率和內(nèi)源性EGFR表達(dá)量的角度篩選最合適的肺癌細(xì)胞系。分別用構(gòu)建成功的重組泛素連接酶與EGFR質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞系，并用重組泛素連接酶轉(zhuǎn)染 EGFR高表達(dá)的肺癌細(xì)胞系，分別設(shè)立實(shí)驗(yàn)組，陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組，檢測(cè)重組泛素連接酶對(duì)靶蛋白水平的影響，結(jié)果顯示三種重組泛素連接酶均能不同程度的降解靶蛋白。證明靶蛋白下降后，設(shè)計(jì)引物并進(jìn)行Real-time PCR實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)重組泛素連接

11、酶對(duì)靶蛋白的mRNA的影響，以證明重組泛素連接酶的干預(yù)作用是在翻譯后水平。
　　實(shí)驗(yàn)三：根據(jù)實(shí)驗(yàn)二的結(jié)果，進(jìn)一步進(jìn)行細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)，分別設(shè)立實(shí)驗(yàn)組，陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組，利用MTT比色實(shí)驗(yàn)、平板克隆形成實(shí)驗(yàn)以及Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)重組泛素連接酶對(duì)腫瘤細(xì)胞的增殖能力和轉(zhuǎn)移侵襲能力的影響；將重組質(zhì)粒與多西他賽聯(lián)合用藥檢測(cè)重組質(zhì)粒對(duì)多西他賽的協(xié)同作用。結(jié)果顯示，兩種重組泛素連接酶能夠明顯的抑制腫瘤細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移侵襲能力，能顯著促使

12、腫瘤細(xì)胞凋亡。
　　實(shí)驗(yàn)四：將構(gòu)建成功的重組泛素連接酶與接頭蛋白TRAF2、6共同轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞系，設(shè)立 pFLAG-CMV4-TRIP-U-box為實(shí)驗(yàn)組，pFLAG-CMV4-TRIP為陰性對(duì)照組和空載體pFLAG-CMV4為對(duì)照，檢測(cè)重組泛素連接酶對(duì)靶蛋白水平的影響，免疫印跡結(jié)果顯示重組泛素連接酶pFLAG-CMV4-TRIP-U-box能促使靶蛋白表達(dá)下調(diào)。利用免疫共沉淀證實(shí)重組泛素連接酶pFLAG-CMV4-TRIP-

13、U-box能夠與TRAF6直接結(jié)合。直接證明了兩者間的相互作用。
　　綜上所述，在多種腫瘤細(xì)胞中都存在RTK的異?；罨瓦^(guò)度表達(dá)，靶向降解這些分子是行之有效的抑制腫瘤的方法。EGFR是RTK家族中的重要成員，參與腫瘤細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化。雖然目前針對(duì)EGFR的靶向治療面對(duì)著耐藥的巨大挑戰(zhàn)，但是它們依舊是腫瘤治療中的理想靶位。泛素化是一種常見(jiàn)的翻譯后修飾方式，通過(guò)泛素化修飾介導(dǎo)蛋白質(zhì)的泛素-蛋白酶體降解途徑，理論上能夠使任意底物蛋白發(fā)生降