泛素連接酶CRRF與腫瘤發(fā)生發(fā)展之間關(guān)系的功能研究.pdf

1、侵襲性(Invasion)和轉(zhuǎn)移性(metastasis)是惡性腫瘤的主要特征，也是目前腫瘤研究和治療中的重點(diǎn)和難點(diǎn)。腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移是一個(gè)多步驟，多階段的復(fù)雜過(guò)程，與腫瘤細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)性、血管發(fā)生能力、自身免疫逃逸以及黏附性等都有著密切的關(guān)系。目前腫瘤的診斷和治療以腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移數(shù)目、其它器官和組織是否轉(zhuǎn)移作為標(biāo)準(zhǔn)，臨床上對(duì)于某些腫瘤相關(guān)分子的免疫組化檢測(cè)已經(jīng)成為常規(guī)的判斷腫瘤惡性程度的指標(biāo)，但同時(shí)臨床上的免疫組化檢測(cè)并沒有相對(duì)公認(rèn)的

2、金指標(biāo)，無(wú)法以單一分子作為判斷標(biāo)準(zhǔn)，因此新的分子檢測(cè)指標(biāo)的引入將對(duì)于提高臨床上腫瘤惡性程度判斷的準(zhǔn)確性提供新的更為可靠的線索。 本實(shí)驗(yàn)室發(fā)現(xiàn)和正在研究的CRRF蛋白(CancerRelatedRINGfinger)在功能上未有報(bào)道，我們對(duì)基因芯片進(jìn)行初步分析發(fā)現(xiàn)CRRF在多種惡性腫瘤中的表達(dá)水平高于正常組織和外周血單核細(xì)胞。同時(shí)對(duì)六種侵襲能力不同的食管癌細(xì)胞進(jìn)行CRRF的表達(dá)檢測(cè)時(shí)，發(fā)現(xiàn)其在三種侵襲能力較強(qiáng)的KYSE180、KY

3、SE450、E.C.9706中能夠檢測(cè)到，而于另三種侵襲能力較弱的KYSE2、KYSE410、KYSE450細(xì)胞中檢測(cè)不到，提示著CRRF蛋白的存在與否與腫瘤細(xì)胞的侵襲水平相關(guān)。為了確定這一現(xiàn)象并在接近體內(nèi)水平檢測(cè)CRRF的表達(dá)與腫瘤惡性程度的關(guān)系，我們利用免疫組化對(duì)大樣本量的胰腺癌組織和結(jié)腸癌組織的CRRF表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)CRRF主要在惡性程度較高的Ⅱ級(jí)和Ⅲ級(jí)腫瘤樣本中表達(dá)比例較高，而在惡性程度較低高分化的Ⅰ級(jí)組織樣本中陽(yáng)性率比

4、例較低。這一結(jié)果表明CRRF的表達(dá)狀態(tài)與腫瘤惡性程度的演進(jìn)有一定的聯(lián)系。這一結(jié)果表明CRRF蛋白質(zhì)可能在某些類型腫瘤惡化過(guò)程中起著調(diào)節(jié)的作用。 CRRF編碼基因全長(zhǎng)為1146個(gè)堿基，共編碼381個(gè)氨基酸。CRRF蛋白具有N端蛋白酶相關(guān)結(jié)構(gòu)域(PAdomain)和C端指環(huán)結(jié)構(gòu)域(RINGfingerdomain)。N端PA結(jié)構(gòu)域在多種類型的蛋白酶以及植物囊泡分選受體中有發(fā)現(xiàn)，但目前功能未知。PA結(jié)構(gòu)域還發(fā)現(xiàn)能夠與指環(huán)結(jié)構(gòu)域位于同一

5、蛋白質(zhì)中形成一類PA-RING蛋白家族，CRRF既是家族成員之一。CRRF蛋白結(jié)構(gòu)中還具有N端的信號(hào)肽和位于中間位置的跨膜區(qū)，我們通過(guò)試驗(yàn)證明CRRF定位于細(xì)胞漿中并呈點(diǎn)狀分布，同時(shí)CRRF溶于表面活性劑TritonX-114而不溶于水相，推測(cè)CRRF可能是一個(gè)TypeⅠ跨膜蛋白。另外，利用衣霉素(Tunicamycin)處理細(xì)胞及PNGaseF處理蛋白樣品，發(fā)現(xiàn)CRRF的分子量減少，提示CRRF是一個(gè)N-糖基化修飾蛋白，進(jìn)一步確定第8

6、8位天冬酰胺是CRRF的糖基化修飾位點(diǎn)。通過(guò)體外及細(xì)胞水平的泛素化檢測(cè)，我們證明了CRRF具有泛素連接酶活性，并且泛素結(jié)合酶UbcH5a和UbcH5c也參與CRRF發(fā)揮其功能。對(duì)指環(huán)結(jié)構(gòu)域保守氨基酸進(jìn)行突變則其泛素連接酶活性即減弱甚至喪失，說(shuō)明指環(huán)結(jié)構(gòu)域結(jié)構(gòu)的保守性及重要性。此上對(duì)CRRF蛋白性質(zhì)的鑒定表明CRRF是一個(gè)位于細(xì)胞內(nèi)膜系統(tǒng)中具有泛素連接酶活性的糖蛋白。 同時(shí)我們也發(fā)現(xiàn)在胰腺癌實(shí)體瘤和淋巴瘤Jurkat、Raji中，

7、CRRF的表達(dá)與細(xì)胞對(duì)于As2O3引起的細(xì)胞凋亡的抵抗能力有關(guān)。在高表達(dá)CRRF的實(shí)體瘤和淋巴瘤細(xì)胞Raji中，細(xì)胞表現(xiàn)出對(duì)As2O3的敏感；而在不表達(dá)或少量表達(dá)CRRF的實(shí)體瘤和淋巴瘤細(xì)胞Jurkat中，細(xì)胞則表現(xiàn)出明顯的抵抗，凋亡比例較少。根據(jù)已有報(bào)道，As2O3引起細(xì)胞中活性氧(ReactiveOxygenSpecies，ROS)的產(chǎn)生引起細(xì)胞分化和凋亡，因此以上現(xiàn)象提示著CRRF可能作用于細(xì)胞中的活性氧自由基清除酶系統(tǒng)而使得細(xì)胞

8、對(duì)As2O3的敏感性存在差異。 為在分子水平上闡明CRRF的作用機(jī)理，我們對(duì)其相互作用蛋白(包括底物)進(jìn)行了篩選和鑒定。篩選得到SNARE相關(guān)蛋白Snapin能夠與其相互作用，并通過(guò)GSTpulldown、免疫沉淀、共定位試驗(yàn)得以驗(yàn)證，并且證明CRRF蛋白的C末端介導(dǎo)了兩者的相互作用。在體外系統(tǒng)中，Snapin能夠被CRRF泛素化。有趣的是，Snapin的表達(dá)水平在細(xì)胞轉(zhuǎn)染不同劑量CRRF時(shí)的檢測(cè)發(fā)現(xiàn)Snapin在高劑量CRRF