中國(guó)野生華東葡萄泛素連接酶基因VpPUB24功能研究.pdf

1、葡萄是世界范圍內(nèi)被廣泛栽培利用的重要果樹之一，特別是歐洲葡萄(Vitis viniferaL.)，其品種在葡萄生產(chǎn)上占主導(dǎo)地位，既可用于鮮食，又可用于制汁，制干和釀酒等加工用途，具有良好的食用品質(zhì)和商業(yè)價(jià)值，為人類創(chuàng)造了巨大經(jīng)濟(jì)效益。但是，歐洲葡萄絕大多數(shù)品種不抗病，尤其是白粉病。我國(guó)是世界葡萄起源中心之一，擁有豐富的野生葡萄資源，其中，中國(guó)野生華東葡萄白河-35-1高抗葡萄白粉病。本研究以白河-35-1為材料，分離獲得U-box類型的

2、泛素連接酶中與抗白粉病相關(guān)基因，分析基因結(jié)構(gòu)，對(duì)基因表達(dá)模式與調(diào)控抗性功能進(jìn)行研究，取得的主要結(jié)果如下:
　　(1)采用RT-PCR技術(shù)檢測(cè)得到中國(guó)野生華東葡萄白河-35-1中56個(gè)U-box類型的泛素連接酶基因在接種白粉菌后表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)VpPUB24基因受白粉菌誘導(dǎo)表達(dá)。
　　(2)采用RACE(Rapid amplification of cDNA ends)克隆技術(shù)獲得泛素連接酶VpPUB24的cDNA序列，VpPU

3、B24全長(zhǎng)為1457 bp，開放讀碼框1236 bp，編碼411個(gè)氨基酸，具有一個(gè)N端的U-box保守結(jié)構(gòu)域和4個(gè)串聯(lián)的ARM保守結(jié)構(gòu)域，其GenBank登錄號(hào)為:KU296025。同時(shí)還克隆了三個(gè)歐洲葡萄品種紅地球、赤霞珠和無核白葡萄中PUB24基因，比對(duì)分析發(fā)現(xiàn)VpPUB24氨基酸序列與三種歐洲葡萄中VvPUB24氨基酸序列一致性為100％。
　　(3)克隆VpPUB24基因啟動(dòng)子片段，并構(gòu)建PVpPUB24-GUS融合載體，

4、轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌GV3101后瞬時(shí)轉(zhuǎn)化白河-35-1葡萄葉片后進(jìn)行不同的生物和非生物脅迫處理，并進(jìn)行啟動(dòng)子GUS蛋白活性定量分析。結(jié)果表明VpPUB24基因受葡萄白粉菌、SA、MeJA及4℃低溫處理誘導(dǎo)表達(dá)。同時(shí)克隆了紅地球、赤霞珠和無核白葡萄中PUB24基因啟動(dòng)子序列，通過PlantCARE網(wǎng)站分析表明歐洲葡萄PUB24啟動(dòng)子中的一個(gè)P-box元件在華東葡萄白河-35-1葡萄中被一個(gè)TCA-element所取代。GUS組織化學(xué)染色試驗(yàn)表明，

5、不同葡萄中PUB24啟動(dòng)子均受白粉菌和SA誘導(dǎo)表達(dá)，并且華東葡萄白河-35-1和三個(gè)歐洲葡萄品種PUB24啟動(dòng)子受白粉菌和SA誘導(dǎo)表達(dá)情況存在一定差異。
　　(4)構(gòu)建中國(guó)野生華東葡萄白河-35-1的酵母cDNA文庫(kù)，通過酵母雙雜交技術(shù)篩選到VpPUB24蛋白的兩個(gè)互作蛋白VpICE1和VpEXO70B1。VpICE1是一個(gè)bHLH類型的轉(zhuǎn)錄因子基因，開放讀碼框?yàn)?551 bp，編碼516個(gè)氨基酸，其GenBank登錄號(hào)為:KU2

6、96026。VpEXO70B1是EXO70家族的基因，是胞外分泌復(fù)合體(Exocyst)的一個(gè)亞基，參與細(xì)胞胞吐和囊泡轉(zhuǎn)運(yùn)，其具有一個(gè)EXO70保守結(jié)構(gòu)域，開放讀碼框?yàn)?884 bp，編碼627個(gè)氨基酸，其GenBank登錄號(hào)為:KU507498。
　　(5)通過雙分子熒光互補(bǔ)(Bimolecular Fluorescence Complementation，BiFC)和免疫共沉淀(Co-Immunoprecipitation，C

7、o-IP)試驗(yàn)證明了VpPUB24與VpEXO70B1的互作關(guān)系?？寺×伺cVpPUB24基因序列一致性最高的VpPUB23基因，通過酵母雙雜交驗(yàn)證明VpPUB23與VpEXO70B1蛋白不互作，說明VpPUB24與VpEXO70B1蛋白的互作具有特異性。通過煙草葉片瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng)證明了VpEXO70B1蛋白的降解受泛素化調(diào)控，VpPUB24促進(jìn)VpEXO70B1蛋白降解。將VpPUB24基因穩(wěn)定整合到擬南芥后，發(fā)現(xiàn)VpPUB24基因通過調(diào)

8、控水楊酸路徑上關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)基因的表達(dá)，負(fù)調(diào)控對(duì)白粉菌的抗性。并通過亞細(xì)胞定位分析發(fā)現(xiàn)VpPUB24與VpEXO70B1蛋白的亞細(xì)胞定位受到SA的影響。克隆了華東葡萄白河-35-1、紅地球、赤霞珠和無核白葡萄中EXO70B1基因及啟動(dòng)子，通過GUS組織化學(xué)染色分析表明，不同葡萄EXO70B1基因均受白粉菌和SA誘導(dǎo)表達(dá)。通過葡萄葉片瞬時(shí)表達(dá)試驗(yàn)，證明了VpPUB24和VpEXO70B1基因通過調(diào)控SNC1、NPR1、PR1等基因的表達(dá)參與對(duì)葡

9、萄白粉菌抗性的調(diào)控。
　　(6)通過酵母雙雜交試驗(yàn)證明了VpPUB24還與VpICE1互作，其C端的ARM結(jié)構(gòu)域介導(dǎo)與VpICE1的C端ACT結(jié)構(gòu)域互作;BiFC和Co-IP試驗(yàn)也證明了VpPUB24與VpICE1蛋白互作。通過酵母雙雜交試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)VpPUB24也與葡萄中ICE家族的另外兩個(gè)成員VpICE2和VpICE3互作;進(jìn)一步分析表明，VpICE1蛋白的降解受泛素化調(diào)控，但VpPUB24促進(jìn)VpICE1蛋白的積累。還克隆了Vp

10、 HOS1基因，通過酵母雙雜交和雙分子熒光互補(bǔ)試驗(yàn)證明了VpHOS1與VpICE1蛋白互作，蛋白降解試驗(yàn)證明了VpHOS1促進(jìn)VpICE1蛋白的降解，而VpPUB24通過抑制VpHOS1蛋白的積累促進(jìn)VpICE1蛋白的積累。此外，還通過酵母雙雜交試驗(yàn)證明了VpHOS1與VpPUB24蛋白在酵母中互作。通過轉(zhuǎn)基因擬南芥分析表明，VpPUB24通過調(diào)控ICE1-CBF/DREB1路徑相關(guān)基因表達(dá)正調(diào)控對(duì)低溫的抗性。
　　綜上所述，中國(guó)