尿液檢測(cè)HIV抗體膠體金免疫層析快速診斷試紙條的研制以及pET28a-gp41重組質(zhì)粒的構(gòu)建.pdf

1、獲得性免疫缺陷綜合征(Acquired Immunodeficiency Syndrome，AIDS)是由人免疫缺陷病毒(Human Immunodeficiency Virus，HIV)感染所致的以循環(huán)CD4+T細(xì)胞顯著下降、機(jī)會(huì)感染及惡性疾病為特征的繼發(fā)性免疫缺陷綜合征。在HIV感染后，最先能夠監(jiān)測(cè)到的是病毒RNA、然后是p24抗原，最后是抗體。在全世界范圍早期對(duì)HIV的檢測(cè)主要是通過血清學(xué)試驗(yàn)檢測(cè)抗HIV的抗體，間接地診斷HIV感

2、染。 檢測(cè)血液中的抗HIV抗體一直被認(rèn)為是診斷AIDS的前提。傳統(tǒng)的血液檢測(cè)法對(duì)醫(yī)院的環(huán)境設(shè)施及相關(guān)醫(yī)務(wù)人員水平有較高的要求，檢測(cè)周期也較長(zhǎng)，而且還存在交叉感染的危險(xiǎn)。但近來研究表明，在HIV感染者的尿液中也可檢查到HIV抗體，這一發(fā)現(xiàn)為艾滋病檢測(cè)提供了一個(gè)全新的發(fā)展方向，從尿液標(biāo)本中進(jìn)行HIV抗體檢測(cè)也成為了國(guó)際上最新的非侵入性診斷艾滋病毒的新技術(shù)。 中國(guó)是一個(gè)多民族的國(guó)家，HIV/AIDS高發(fā)區(qū)在西部地區(qū)也以少數(shù)民族

3、為主，而且70.6％的HIV感染源由于靜脈毒癮，因此，血液標(biāo)本的采集是HIV/AIDS防治工作中的一個(gè)大的問題。與血液檢查相比，尿液檢查有多種優(yōu)點(diǎn)：尿液中一般不存在HIV病毒、采集時(shí)不會(huì)引起皮膚損傷。所以尿液HIV—1抗體檢查是一種相對(duì)安全而便捷的檢測(cè)方法。尿液檢測(cè)HIV/AIDS工作的開展，做到了無損傷檢測(cè)，很好地解決了這一問題，使HIV篩查工作有了更好的措施，對(duì)于早期發(fā)現(xiàn)HIV感染者具有良好的社會(huì)和經(jīng)濟(jì)價(jià)值。 本研究力求建立

4、一種快速、簡(jiǎn)易的用于檢測(cè)人尿液中抗HIV—1抗體的膠體金免疫層析試紙條，便于早期HIV的大范圍篩查。同時(shí)本研究研制HIV—1的gp41基因重組抗原，為生產(chǎn)抗HIV抗體診斷試劑提供優(yōu)質(zhì)抗原。 方法： 一．膠體金免疫層析試紙條的研制 采用檸檬酸三鈉還原法制備直徑為20nm的膠體金顆粒，測(cè)定膠體金與標(biāo)記用gp41抗原的最適用量之比；標(biāo)記HIV—1 gp—41抗原，將標(biāo)記物噴于預(yù)先處理過的玻璃纖維上。將包被用抗原劃點(diǎn)固定

5、于硝酸纖維素膜上，用于抗HIV—1抗體的捕捉，同時(shí)將包被用抗HIV—1 gp41的鼠源性單克隆抗體劃點(diǎn)固定于硝酸纖維素膜上；按常規(guī)組裝成免疫層析檢測(cè)試條。 二．pET28a—gp41重組質(zhì)粒的構(gòu)建 通過RT-PCR擴(kuò)增合成目的片段，然后用限制性內(nèi)切酶將其與原核表達(dá)載體pET—28a定向連接，構(gòu)建成重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5a菌中，挑陽(yáng)性克隆，雙酶切鑒定產(chǎn)物，并進(jìn)一步進(jìn)行序列測(cè)定。 結(jié)果： 一．HIV—1

6、gp41抗體的檢測(cè) 陽(yáng)性HIV患者尿液中的抗HIV抗體與測(cè)試條上金標(biāo)記物結(jié)合后沿著硝酸纖維素膜移動(dòng)，與膜上的固相抗原結(jié)合形成肉眼可見的紅色圓點(diǎn)。 二．HIV—1跨膜蛋白gp—41載體的構(gòu)建 重組結(jié)果經(jīng)酶切鑒定，證實(shí)構(gòu)建成功。經(jīng)測(cè)序進(jìn)一步證明插入基因正確 結(jié)論： 1.本研究所研制的膠體金免疫層析試紙條臨床應(yīng)用方便、安全、經(jīng)濟(jì)，在HIV早期大范圍篩查中具備很大的市場(chǎng)價(jià)值。 2.已成功構(gòu)建了HI