細粒棘球蚴膠體金免疫層析快速檢測試紙條的研制與初步應用.pdf

1、細粒棘球蚴病，或稱囊型包蟲病，是由細粒棘球蚴（Echinococcus granulosusis）所引起的一種人畜共患性寄生蟲病。在我國感染細粒棘球蚴的動物當中，羊的感染情況最嚴重。但臨床應用中，對細粒棘球蚴病的不同診斷方法，依然存在各自的缺陷。因此，本研究的目的在于建立一種快速、簡便、準確的利于基層診斷的羊細粒棘球蚴檢測方法。
　　本研究對細粒棘球蚴HSP70(Heat shock protein70)蛋白進行了克隆及原核表達，

2、根據(jù)GenBank中的細粒棘球蚴hsp70基因序列，用Primer5軟件設計了特異性引物，以細粒棘球蚴基因組為模板，擴增hsp70片段，將該基因片段克隆至pMD18-T Vector并至感受態(tài)大腸桿菌TOP10，再用PCR及酶切鑒定。經(jīng)過測序鑒定，得到了大小為957bp的目的片段，與GenBank中的序列相比，兩者相似性為99.4％。然后將該片段和表達載體pET30a分別用EcoRⅠ和HindⅢ進行雙酶切鑒定，構建了表達載體pET30a

3、-hsp70，將其轉化至大腸桿菌BL21，用IPTG誘導表達，表達產(chǎn)物經(jīng)過SDS-PAGE分析顯示，細粒棘球蚴HSP70的原核表達成功，蛋白約為43 kDa。接著用純化蛋白免疫新西蘭雄性白兔，第二、第三次免疫后一周采血、析出血清，并進行抗體效價測定，判斷免疫效果;第四次免疫后一周大量采血、析出血清，進行抗體效價及特異性檢測，最終獲得效價為＞1∶51200的多抗。同時，本研究制備了直徑約為15nm的膠體金顆粒，以膠體金標記HSP70，制備

4、膠體金試紙條，建立了一種細粒棘球蚴的快速檢測方法。該方法可在20 min內得到檢測結果，400～500倍稀釋待檢血清得到的顯色條帶最明顯，并且在陽性羊血清稀釋到1000倍依舊可以觀察到陽性條帶，與感染肝片吸蟲、捻轉血矛線蟲、小反芻獸疫、口蹄疫的羊陽性血清不發(fā)生交叉反應，且試紙條在4℃保存8個月后依然具有較高的檢測效果。本研究中采集了來自浙江省杭州、溫州、麗水、舟山、臺州、衢州、金華、湖州、嘉興、紹興、寧波11個地區(qū)養(yǎng)殖場的728份羊血清

5、樣品，并應用建立的膠體金免疫層析檢測方法對血清樣品進行檢測，發(fā)現(xiàn)樣品中呈陽性的有19份，浙江省這11個地區(qū)的總檢測陽性率為2.61％。對羊血清樣品的檢測數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析，結果顯示浙江省部分地區(qū)羊的細粒棘球蚴感染明顯少于西北地區(qū)，提示在浙江省地區(qū)對該病的防治工作做得相對較好。
　　綜上所述，本研究基于細粒棘球蚴hsp70基因建立了一種可靠的膠體金試紙條檢測方法，運用該方法對浙江省11個地區(qū)養(yǎng)殖場的羊血清樣本進行檢測，并對試驗數(shù)據(jù)進