牛干擾素-tau的原核表達及生物活性鑒定.pdf

1、IFN-τ是反芻動物妊娠后胚胎向母體發(fā)出的最初妊娠信號，在母體妊娠識別過程中起著重要的作用。本試驗以牛體內胚胎為材料，通過一步法PCR從胚胎基因組中擴增牛IFN-τ基因(含信號肽)，擴增產物與中間載體pGEM-T Vector連接，經過酶切和。DNA測序鑒定后，通過定向克隆分別將含信號肽和不含信號肽的牛IFN-τ基因與原核表達載體pET-30a(+)連接，并分別命名為pET-blFNS(+)-τ和pET-bIFNS(-)-τ,采剛IPT

2、G進行誘導表達，采用10M尿素溶解包涵體，通過Ni<'2+>親合層析進行純化，通過抗病毒活性檢測和對牛子宮內膜上皮細胞的影響兩個方面鑒定rblFN-τ的生物活性。 實驗結果表明，通過一步法 PCR擴增得到的牛IFN-τ(含信號肽)基因與已知序列(XM593584)比對后，核苷酸和氨基酸序列的同源性分別達99％和97％，證明成功克隆了牛IFN-τ基因(含信號肽)。在25℃和37℃條件下，采用0.1mM IPTG進行誘導，SDS-P

3、AGE電泳檢測，含有信號肽的pET-bIFNS(+).-τ質粒與誘導前和空載體相比，誘導后，在約20kD處均無特異性蛋白條帶產生，而不含信號肽的pET-bIFNS(-)-τ質粒誘導后與對照相比，在約20kD處均有特異性條帶產生，證明不含信號肽的牛IFN-τ基因可以在大腸桿菌中進行表達，并且表達量高。牛IFN-τ在誘導表達過程中，形成了不溶性的包涵體，經過10M尿素溶解后，部分rbIFN-τ從沉淀中轉移至上清中，在活性條件下，純化得到了純