煙草環(huán)斑病毒檢測及其cp基因片段原核表達.pdf

1、本研究根據(jù)genbank中公布的煙草環(huán)斑病毒(Tobacco ring spot virus，TRSV)5個分離物的外殼蛋白全序列設(shè)計3對特異性引物，建立了煙草環(huán)斑病毒分子生物學(xué)(包括RT-PCR、巢式PCR、實時熒光RT-PCR)檢測體系，研究了每對引物的特異性，通過提純的TRSV粗提液進行靈敏度試驗，并與雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附法(DAS-ELISA)、膠體金免疫試紙條法(CGIS)檢測的靈敏度進行比較研究。結(jié)果表明：所設(shè)計引物的特異

2、性好，均不與同屬其他種病毒發(fā)生交叉反應(yīng)；在進行靈敏度試驗時，DAS-EIJSA、CGIS最低檢測量分別為100ng和200ng，TRSV-F/R-1的RT-PCR最低檢測量10ng，TRSV-F/R-2的RT-PCR最低檢測量1ng，巢式PCR與實時熒光RT-PCR當病毒含量只有100pg時仍可檢測到。 在引物TRSV-F/R-1上分別引入EcoRI和Xho I 酶切位點，以接種在白肋煙上的TRSV為模板，擴增出744bp的TR

3、SV外殼蛋白(TRSV-CP)基因，并將其克隆到PMD-18T載體上，提取質(zhì)粒進行酶切，得到的TRSV-CP基因再重組到原核表達載體pET-28a中，通過菌落PCR、酶切鑒定及序列測定。結(jié)果表明，重組質(zhì)粒pET-TRSV連接區(qū)域符合設(shè)計要求，具有正確的開放閱讀框架，插入片段含有編碼248個氨基酸的完整編碼區(qū)，推測該段氨基酸序列與報道的TRSV外殼蛋白序列的同源性最高達98.2％。重組表達載體導(dǎo)入宿主菌BL21(DE3)，以終濃度為0.4

4、mM/L的IPTG誘導(dǎo)，37℃培養(yǎng)4h后，SDS-PAGE電泳鑒定，得到34kDa的目的蛋白。大量誘導(dǎo)蛋白表達，并經(jīng)過Ni+-NTA純化，純化后的蛋白經(jīng)Western blot分析，再次證明所得的蛋白就是TRSv的外殼蛋白，并且具有免疫學(xué)活性。以純化的重組蛋白免疫新西蘭白兔，制備了多抗血清。ELISA結(jié)果表明，免疫的1號和2號兩只新西蘭大白兔多抗血清與重組蛋白發(fā)生很好的抗原抗體反應(yīng)，效價分別為409600和819200，特異性較好，為開