庫爾勒香梨蘋果莖痘病毒外殼蛋白基因的克隆與原核表達(dá).pdf

1、我國商業(yè)果園果樹主栽品種攜帶病毒十分普遍。在果樹種植面積不斷擴(kuò)大和栽培時間延長的同時，病毒危害越來越重，因此研究人員、果樹生產(chǎn)與經(jīng)營者加大了對病毒的重視。蘋果莖痘病毒（apple stem pitting virus，ASPV）為Foveaviris （Martelli G.P等，1998）的代表種，該病毒寄主范圍和分布較廣，能侵染多種果樹。早期曾將梨莖痘病、梨黃化病、梨紅色斑駁病、梨脈黃病、梨石痘病、蘋果莖痘病的病源歸為不同的病毒種（

2、吳雅琴等，2000），但Jelkmann等證實(shí)以上幾種病害均由ASPV所引起。ASPV因其寄主及地理分布不同而存在差異，目前已分離多個分離物?，F(xiàn)對蘋果莖痘病毒外殼蛋白新疆庫爾勒香梨分離物進(jìn)行克隆，測序，序列分析以及誘導(dǎo)該分離物原核表達(dá)，研究蘋果莖痘病毒的功能區(qū)域。
　　 1.采集經(jīng)RT-PCR檢測確定已帶有蘋果莖痘病毒(Apple stem pitting virus，ASPV)的香梨一二年生的枝條為試驗(yàn)材料，根據(jù)GenBank

3、中的EU095327序列設(shè)計(jì)合成引物，擴(kuò)增ORF5外殼蛋白的核酸序列片段。將目的片段轉(zhuǎn)入到克隆載體中，經(jīng)酶切，測序證實(shí)所得片段為目的片段，與MHczAp、ASPV isolate24、ASPV isolate38分離物核苷酸同源序列分別為81％-83％，氨基酸的同源率分別為70％-71％。
　　 2.酶切連接有目的片段的克隆載體，將目的片段純化，轉(zhuǎn)入表達(dá)載體pET-3a中。挑取陽性菌落，測序，證實(shí)該基因序列表達(dá)框正確。將連接目的

4、基因片段的表達(dá)載體轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21中，經(jīng)過IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，在不同時間均獲得了表達(dá)，且表達(dá)蛋白產(chǎn)物的分子質(zhì)量大小與預(yù)期值一致，并可被特異性抗體所識別。另外，該基因在BL21的表達(dá)具有時效性特點(diǎn)，1～3h里表達(dá)量較高，4h后重組蛋白表達(dá)量開始下降。預(yù)測ASPV CP的蛋白相對分子質(zhì)量為43.7kDa，與實(shí)驗(yàn)檢測的重組蛋白相對分子質(zhì)量基本一致。
　　 本文將克隆與原核表達(dá)技術(shù)應(yīng)用于新疆庫爾勒香梨蘋果莖痘病毒的研究，通過蘋果莖痘病