乙醛脫氫酶1A2的表達和分布與SOD1-G93A轉(zhuǎn)基因小鼠脊髓神經(jīng)元的死亡密切相關(guān).pdf

1、背景與目的：
　　肌萎縮側(cè)索硬化癥（ALS）是一種累及腦與脊髓上下運動神經(jīng)元，以進行性和選擇性損傷運動神經(jīng)元為主要特點的致死性神經(jīng)變性病。起病隱匿，患者常在3-5年內(nèi)因呼吸肌麻痹而致死，預后很差，而且目前無針對其特異性的診斷和治療方法。目前，力魯唑是由美國FDA批準的目前唯一在人群中得到證實對肌萎縮側(cè)索硬化癥有效的藥物，但也只能延緩2-3月的壽命，且耗資巨大。肌萎縮側(cè)索硬化癥的發(fā)病機制尚不完全明確，近年來大量學者對肌萎縮側(cè)索硬化癥

2、致病蛋白進行了研究，但多數(shù)是重復性驗證研究，已發(fā)現(xiàn)的致病蛋白只能解釋肌萎縮側(cè)索硬化癥的部分發(fā)病機制。找到敏感的疾病相關(guān)蛋白，不僅可以達到早期診斷ALS、跟蹤疾病進展、評估治療后的反應的目的以及更好地理解ALS的分子發(fā)病機制，同時也為此后進一步闡明SOD1-G93A突變相關(guān)ALS的生物通路和分子機制建立基礎，很多學者均致力于尋找關(guān)于ALS的疾病相關(guān)蛋白的研究。我們這項研究主要也是尋找與肌萎縮側(cè)索硬化癥發(fā)病相關(guān)的新蛋白。我們前期應用iTRA

3、Q技術(shù)對SOD1-G93A轉(zhuǎn)基因小鼠的腦和脊髓進行了蛋白組學分析，篩選出在腦和脊髓中表達均有差異且意義較大的蛋白，然后應用免疫熒光及Western技術(shù)對篩選出的蛋白進行探查，分析ALDH1A2在SOD1-G93A轉(zhuǎn)基因小鼠脊髓中表達和分布的規(guī)律，并分析ALDH1A2陽性細胞在神經(jīng)細胞的共定位。
　　方法：
　　將正常的C57BL/6J小鼠與SOD1*G93A轉(zhuǎn)基因小鼠進行交配繁殖，構(gòu)建動物模型，用PCR技術(shù)檢測和篩選SOD1

4、-G93A陽性子代小鼠，采用Western blot對實驗組和對照組小鼠ALDH1A2陽性細胞的表達量進行分析；利用熒光免疫組織化學單標技術(shù)對實驗組和對照組小鼠ALDH1A2陽性細胞的分布特征進行觀察和分析，應用Image-Pro Plus6.0軟件對ALDH1A2陽性細胞數(shù)、計算陽性細胞率進行統(tǒng)計；采用免疫熒光雙標記技術(shù)，分別標記神經(jīng)元細胞（Fox3/NeuN）、少突膠質(zhì)細胞（Oligodendrocyte）、星形膠質(zhì)細胞（GFAP）

5、、小膠質(zhì)細胞（IBA-1），用熒光免疫組織化學染色法對每一解剖區(qū)同時進行雙重染色，然后利用圖像處理技術(shù)將染色的陽性細胞疊加成像，在顯微鏡下觀察和分析陽性細胞和神經(jīng)細胞的共定位關(guān)系。
　　結(jié)果：
　　本研究是首個針對ALDH1A2與ALS相關(guān)性的研究，得到以下結(jié)果：
　?。?）ALDH1A2的前期iTRAQ分析結(jié)果
　　本實驗室前期iTRAQ分析結(jié)果，與正常野生型小鼠相比，ALDH1A2是一種在SOD1-G93A轉(zhuǎn)

6、基因小鼠腦和脊髓中均有表達的差異蛋白，表達水平呈現(xiàn)如下規(guī)律：在SOD1-G93A進展組小鼠及正常對照組小鼠脊髓組織中的豐度比為0.63，實驗組<對照組;在實驗組中，未發(fā)病組<進展組<發(fā)病組。
　?。?）Western blot的驗證結(jié)果
　　與前期 iTRAQ蛋白組學分析的結(jié)果完全一致，即對照組小鼠脊髓中ALDH1A2的表達水平高于實驗組小鼠脊髓。
　?。?）免疫熒光雙標實驗的驗證結(jié)果
　　觀察到ALDH1A2陽

7、性細胞與FOX3/NeuN、IBA1、Oligodendrocyte、GFAP陽性細胞在實驗組和對照組小鼠脊髓灰質(zhì)內(nèi)均存在共定位，說明了ALDH1A2能在上述四種細胞中表達。
　?。?）免疫熒光單標實驗的驗證結(jié)果
　　ALDH1A2陽性細胞廣泛分布于實驗組和對照組小鼠的脊髓灰質(zhì)和白質(zhì)內(nèi)。
　　疾病作為獨立影響因素時，ALDH1A2陽性細胞百分率對照組＞實驗組，兩組比較具有統(tǒng)計學意義（P=0.02）；節(jié)段作為獨立影響因素

8、時，ALDH1A2陽性細胞百分率頸段＞胸段＞腰段，三組比較有顯著統(tǒng)計學意義（P=0.00），兩兩比較除頸段和胸段相比無明顯差異外，頸段和腰段相比、胸段和腰段相比均有統(tǒng)計學差異；區(qū)域作為獨立影響因素時，白質(zhì)各區(qū)域＞灰質(zhì)各區(qū)域，六組比較有顯著統(tǒng)計學意義（P=0.00），灰白質(zhì)之間兩兩相比無明顯統(tǒng)計學差異；年齡作為獨立影響因素時，ALDH1A2陽性細胞百分率發(fā)病組＞進展組＞未發(fā)病組，三組比較有顯著統(tǒng)計學意義（P=0.00），且兩兩比較均有統(tǒng)計

9、學差異；年齡和疾病因素對小鼠脊髓ALDH1A2陽性細胞百分率的影響存在交互作用，一個影響因素的變化均可引起另一個因素的變化。
　　結(jié)論：
　　ALDH1A2蛋白在SOD1-G93A轉(zhuǎn)基因小鼠及正常對照小鼠脊髓不同解剖區(qū)域、不同節(jié)段、不同年齡階段的表達和分布規(guī)律：ALDH1A2陽性細胞廣泛分布于對照組和實驗組小鼠的脊髓灰質(zhì)和白質(zhì)內(nèi)，當年齡、解剖區(qū)域、疾病、節(jié)段作為獨立因素存在時，均可影響小鼠脊髓ALDH1A2的陽性細胞百分率，