體外低氧環(huán)境對(duì)人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨誘導(dǎo)分化影響的初步研究.pdf

1、第一部分人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的體外培養(yǎng)及鑒定 目的：體外分離培養(yǎng)人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（hMSCs）并進(jìn)行鑒定，為組織工程提供適宜的種子細(xì)胞。 方法：抽取健康成人骨髓，采用人淋巴細(xì)胞分離液分離純化獲取hMSCs，觀察細(xì)胞形態(tài)特征、生長(zhǎng)狀況，從表面抗原表達(dá)及成骨分化能力兩個(gè)方面進(jìn)行鑒定。 結(jié)果：分離細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)，呈集落樣增殖，放射狀、渦漩狀分布排列。免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)細(xì)胞表達(dá)CD44和CD71，CD34、CD45 呈陰性表

2、達(dá)，細(xì)胞表面標(biāo)志表達(dá)與間充質(zhì)干細(xì)胞的特征一致。分離的細(xì)胞經(jīng)過(guò)成骨條件培養(yǎng)基誘導(dǎo)分化后2周，細(xì)胞堿性磷酸酶染色陽(yáng)性，4周后可以形成鈣結(jié)節(jié)，證明所培養(yǎng)細(xì)胞有向成骨細(xì)胞分化的潛能。表明分離細(xì)胞為間充質(zhì)干細(xì)胞。 結(jié)論：采用人淋巴細(xì)胞分離液分離細(xì)胞，能獲得較為純化的hMSCs，可為培養(yǎng)hMSCs提供穩(wěn)定的分離方法。 第二部分低氧環(huán)境對(duì)人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞生物學(xué)行為的影響。 目的：建立人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（human mesen

3、chymal stem cells，hMSCs）體外低氧培養(yǎng)及向成骨細(xì)胞分化的生物模型，研究其生物學(xué)特征，為骨組織工程提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 方法：采用人淋巴細(xì)胞分離液分離健康成人骨髓中的間充質(zhì)干細(xì)胞。取第3代細(xì)胞，根據(jù)培養(yǎng)氧濃度及培養(yǎng)基類(lèi)型分為4組：正常氧組（20％O2加DMEM-LG）、低氧組（1％O2加DMEM-LG）、正常氧成骨誘導(dǎo)組（20％O2加條件培養(yǎng)基）及低氧成骨誘導(dǎo)組（1％O2加條件培養(yǎng)基），通過(guò)細(xì)胞計(jì)數(shù)、細(xì)胞增殖測(cè)定（

4、MTT法）、增殖細(xì)胞核抗原（PCNA）檢測(cè)、凋亡蛋白及集落形成檢測(cè)，觀察低氧對(duì)hMSCs增殖凋亡的影響；RT-PCR檢測(cè)、ALP活性檢測(cè)及茜素紅染色，研究低氧環(huán)境對(duì)hMSCs成骨分化的影響；檢測(cè)Fibronectin、Laminin和CollagenⅠ蛋白表達(dá)，觀察低氧對(duì)hMSCs細(xì)胞外基質(zhì)分泌的影響。 結(jié)果：與正常氧組相比，低氧組中的hMSCs有較高的增殖速度，生長(zhǎng)差異顯著(P<0.05)；低氧組中PCNA染色細(xì)胞增多，高于正

5、常氧組（P<0.05）；低氧組中凋亡細(xì)胞減少，抗凋亡蛋白bcl-2表達(dá)增多（P<0.05）；低氧組中的hMSCs生成的集落逐漸增多，明顯高于正常氧組。低氧成骨誘導(dǎo)組培養(yǎng)的hMSC堿性磷酸酶活性逐漸增高，但明顯低于正常氧成骨誘導(dǎo)組，兩者有明顯的差異（P<0.01）；定量RT-PCR檢測(cè)，正常氧成骨誘導(dǎo)組ALP、OC、COL1A2及BSP mRNA表達(dá)量明顯增加，ALP、OC、COL1A2及BSP mRNA明顯增高（P＜0.01)；培養(yǎng)4周

6、后，與其它三組相比，正常氧成骨誘導(dǎo)組可見(jiàn)到明顯的鈣鹽沉積和染成紅色的鈣結(jié)節(jié)。免疫組織化學(xué)和Western blot檢測(cè)，低氧組中FN和LA分泌增多（P<0.05），CollagenⅠ蛋白表達(dá)無(wú)顯著差異（P<0.05）。 結(jié)論：低氧使hMSCs增殖率增加，集落形成能力增強(qiáng)，抑制成骨細(xì)胞分化，保持干細(xì)胞特征，促進(jìn)hMSCs分泌細(xì)胞外基質(zhì)。 第三部分慢性低氧影響HIF-1α、SDF-1及VEGF165在hMSCs中的表達(dá)。

7、 目的：建立體外hMSCs低氧模型，觀察慢性低氧對(duì)hMSCs表達(dá)HIF-1α（低氧誘導(dǎo)因子－1α）、SDF-1（基質(zhì)細(xì)胞衍生因子－1）及VEGF165（血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子）的影響，為hMSCs治療缺氧性疾病提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。通過(guò)比較HIF-1α、SDF-1及VEGF165，探討低氧抑制hMSCs成骨分化的機(jī)制。 方法：采用人淋巴細(xì)胞分離液分離健康成人骨髓中的間充質(zhì)干細(xì)胞。取第3代細(xì)胞，根據(jù)培養(yǎng)氧濃度及培養(yǎng)基類(lèi)型分為4組：正常氧

8、（n組）（20％O2加DMEM-LG）、低氧組（h組）（1％O2加DMEM-LG）、正常氧成骨誘導(dǎo)組（nos組）（20％O2加條件培養(yǎng)基）及低氧成骨誘導(dǎo)組（hos組）（1％O2加條件培養(yǎng)基），運(yùn)用免疫組織化學(xué)檢測(cè)HIF-1α、SDF-1及VEGF蛋白表達(dá)，western blot檢測(cè)HIF-1α及SDF-1蛋白表達(dá)，定量RT-PCR檢測(cè)HIF-1α、SDF-1及VEGF165 mRNA表達(dá)。 結(jié)果：n組和nos組hMSCs細(xì)胞質(zhì)

9、內(nèi)HIF-1α染色陽(yáng)性，h組和hos組hMSCs胞質(zhì)及胞核內(nèi)均強(qiáng)陽(yáng)性染色。低氧條件下，SDF-1染色細(xì)胞數(shù)目明顯增多，VEGF染色呈陽(yáng)性。hMSCs在慢性低氧的條件下，h組和hos組HIF-1α、SDF-1及VEGF165 mRNA表達(dá)水平明顯增高，與n組相比，兩者有顯著差異（P＜0.05)，而n組和nos組，HIF-1αmRNA表達(dá)始終處于較低的水平（P<0.05），nos組SDF-1 mRNA表達(dá)量持續(xù)增高，14天時(shí)達(dá)到峰值，隨后開(kāi)

10、始降低（P<0.05），n組、h組、nos組及hos組隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，VEGF165 mRNA表達(dá)均逐漸增多，但h組及hos組VEGF mRNA表達(dá)始終高于n組和nos組，nos組14天時(shí)VEGF1165 mRNA表達(dá)量快速增加達(dá)到峰值，隨后開(kāi)始降低（P<0.05）。Western blot檢測(cè)，h組和hos組可見(jiàn)HIF-1α及SDF-1蛋白表達(dá)增多，明顯高于n組和nos組（P<0.05），nos組7天后SDF-1蛋白表達(dá)量明顯增加（P