拉伸應(yīng)力刺激對骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化過程的影響研究.pdf

1、實驗?zāi)康模?br>　　通過對小鼠BMSCs施加一定的拉伸應(yīng)力刺激，研究力學(xué)因素對小鼠BMSCs成骨分化過程的影響，進(jìn)一步探討成骨分化過程中細(xì)胞的生物力學(xué)-生物化學(xué)偶聯(lián)機(jī)制。
　　實驗方法：
　　無菌條件下提取昆明小鼠BMSCs，體外傳代培養(yǎng)至第3代后，進(jìn)行細(xì)胞表型的鑒定。將細(xì)胞接種于底部具有彈性膜的拉伸六孔板上。根據(jù)細(xì)胞不同的培養(yǎng)條件，實驗共分為3組。實驗組(A組)：成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基培養(yǎng)+拉伸刺激；單純誘導(dǎo)組（B組）：成骨誘導(dǎo)

2、培養(yǎng)基培養(yǎng)；空白對照組（C組）：普通培養(yǎng)基培養(yǎng)。采用Flex-cell5000細(xì)胞力學(xué)加載系統(tǒng)給予實驗組6％形變幅度的正弦波刺激，頻率0.5Hz，4h/d。各組細(xì)胞均2天換液1次，共培養(yǎng)1周。實驗結(jié)束后RT-PCR法檢測各組細(xì)胞BMP-2、Runx2和ALP mRNA的表達(dá)情況，ELISA法檢測培養(yǎng)基中Col1的含量，并對各組細(xì)胞進(jìn)行茜素紅染色觀察鈣結(jié)節(jié)形成情況。
　　實驗結(jié)果：
　　1.提取的原代細(xì)胞呈圓形或類圓形，所含雜

3、質(zhì)較多，24h后首次換液，去除漂浮死細(xì)胞，顯微鏡下觀察可見有部分細(xì)胞貼壁，呈短梭形或多角形。繼續(xù)培養(yǎng)48h后以1：2進(jìn)行細(xì)胞傳代，顯微鏡下觀察傳代后細(xì)胞生長加速，呈長梭形、漩渦狀生長。流式細(xì)胞儀細(xì)胞表型鑒定結(jié)果：96.4%的細(xì)胞表達(dá)CD29，97.2%的細(xì)胞表達(dá)CD90，1.7%的細(xì)胞表達(dá)CD34，1.3%的細(xì)胞表達(dá)CD45。
　　2.RT-PCR檢測：細(xì)胞培養(yǎng)1周后，與C組相比，A、B兩組BMP-2、Runx2、ALP的mRNA

4、表達(dá)量均明顯升高，差異具有統(tǒng)計學(xué)差異（P<0.05）。與B組相比， A組BMP-2、Runx2、ALP mRNA表達(dá)量增高，差異有統(tǒng)計學(xué)差異（P<0.05）。
　　3.ELISA檢測Col1的含量：A、B兩組各時間段培養(yǎng)基中Col1的含量均高于C組，且隨著誘導(dǎo)時間的延長逐漸增加。A組培養(yǎng)基中Col1終濃度高于B組，誘導(dǎo)效果最明顯。
　　4.茜素紅染色：倒置顯微鏡下觀察A、B兩組均出現(xiàn)明顯深染鈣結(jié)節(jié)，證明兩組誘導(dǎo)成骨分化均顯著