缺氧對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞骨向分化調(diào)控的體外研究.pdf

1、以成骨細(xì)胞為中心的骨改建是正畸牙移動(dòng)的生物學(xué)基礎(chǔ)，骨對(duì)機(jī)械力的反應(yīng)是通過(guò)什么機(jī)制進(jìn)行的目前并沒(méi)有完全明了。但有一點(diǎn)是肯定的，在正畸力作用下由于壓力側(cè)受壓導(dǎo)致血供減少，形成了缺氧的微環(huán)境。有學(xué)者推測(cè)，氧分壓的改變可能是骨改建中潛在的扳機(jī)點(diǎn)“trigger”?，F(xiàn)已證實(shí)間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)是成骨細(xì)胞的日仃體細(xì)胞，體外經(jīng)誘導(dǎo)可向成骨細(xì)胞分化。關(guān)于缺氧對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞骨向分化的影響及調(diào)控機(jī)理目前尚不清楚。 本研究擬通過(guò)體外分離、純化

2、培養(yǎng)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，建立骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞骨向誘導(dǎo)分化細(xì)胞模型，采用Jouan三氣缺氧培養(yǎng)體系；運(yùn)用熒光標(biāo)記技術(shù)、酶比活力定量檢測(cè)、實(shí)時(shí)熒光定量PCR及Westernblotting蛋白免疫印跡等先進(jìn)技術(shù)方法，研究不同作用時(shí)間的缺氧對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞骨向分化中體現(xiàn)成骨功能效應(yīng)的堿性磷酸酶(ALP)比活性、堿性磷酸酶(ALP)和骨鈣素(0C)基因及骨特異性轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子(Cbfal)基因和蛋白表達(dá)的影響；并對(duì)其絲裂原活化蛋白激酶(MAP

3、Ks)信號(hào)通路中的ERK和P38通路的調(diào)控機(jī)制進(jìn)行初步探索。從細(xì)胞和分子生物學(xué)水平上深入系統(tǒng)地探討機(jī)械力介導(dǎo)的微環(huán)境缺氧對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞骨向分化的調(diào)控，從而為進(jìn)一步闡明正畸牙移動(dòng)骨改建機(jī)理奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。 結(jié)果顯示： 1．通過(guò)密度梯度離心法成功分離培養(yǎng)了rMSCs，結(jié)合貼壁法獲得了較高純度的3～5代rMSCs，并經(jīng)骨向誘導(dǎo)可成功培養(yǎng)出具有成骨細(xì)胞表型的rBMSCs。 2．缺氧對(duì)rBMSCs骨向誘導(dǎo)分化中ALPas

4、e、比活性ALPase及OC mRNA的表達(dá)在作用的前12h均有一過(guò)性的升高作用，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；隨作用時(shí)間的延長(zhǎng)，有較明顯的抑制作用，其中mRNA表達(dá)在72h和96h抑制效應(yīng)最強(qiáng)，具有時(shí)效性。 3．Cbfal／OSF2 mRNA的表達(dá)在缺氧48h后非常下降顯著，幾乎不表達(dá)，72h和96t1分別下調(diào)了90％和89％；而其蛋白水平雖不如基因改變明顯，但仍呈下降趨勢(shì)，在96h也下調(diào)了63％。 4．缺氧培養(yǎng)下5min ER

5、Kl／2 MAPK信號(hào)通路被迅速激活，磷酸化程度升至Omin對(duì)照組的231％； 15min時(shí)有所回落，但仍維持較高激活水平；隨后在45min時(shí)迅速下降，與135min和6h時(shí)一樣維持在一基線水平。而P38 NAPK信號(hào)通路蛋白磷酸化水平無(wú)明顯變化，維持在一基線水平，各時(shí)間點(diǎn)之間沒(méi)有統(tǒng)汁學(xué)差別。 結(jié)論及提示： 1．rMSCs骨向誘導(dǎo)可成功模擬整個(gè)成骨細(xì)胞分化過(guò)程，為后續(xù)研究提供細(xì)胞學(xué)模型。 2．2％缺氧通過(guò)下調(diào)成

6、骨功能蛋白ALPase酶活性、ALPase及OC基因表達(dá)對(duì)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞骨向誘導(dǎo)分化成骨效應(yīng)有抑制作用。 3．2％缺氧對(duì)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞骨向誘導(dǎo)分化中作為成骨細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)錄因子的核心結(jié)合因子Cbfal基因和蛋白表達(dá)的均有顯著抑制作用。 4．ERKl／2 MAPK信號(hào)通路參與了缺氧抑制rBMSCs骨向誘導(dǎo)分化的調(diào)控過(guò)程：而P38 MAPK信號(hào)通路沒(méi)有被激活，可能不參與調(diào)控。 缺氧很有可能就是通過(guò)抑制成骨

7、細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)錄因子cbfal這一關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)下調(diào)ALPase及OC等這些代表成骨細(xì)胞功能狀態(tài)的酶和細(xì)胞外基質(zhì)蛋白的表達(dá)對(duì)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞骨向分化起抑制調(diào)控作用；而細(xì)胞對(duì)外界缺氧的應(yīng)激很有可能是通過(guò)激活了ERKl／2 MAPK信號(hào)通路的級(jí)聯(lián)反應(yīng)介導(dǎo)Cbf α 1活性和表達(dá)發(fā)揮調(diào)控作用，由于間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)問(wèn)題的網(wǎng)絡(luò)性和復(fù)雜性，尚不能說(shuō)明其唯一性和重要性，但至少肯定參與了此調(diào)控過(guò)程。 推測(cè)可能調(diào)控機(jī)制:缺氧應(yīng)激→