模擬微重力對(duì)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞定向成骨誘導(dǎo)分化的影響.pdf_第1頁(yè)
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1、中國(guó)載人航天器“神州七號(hào)”的圓滿(mǎn)成功實(shí)現(xiàn)了中國(guó)太空行走的偉大夢(mèng)想。而下一個(gè)目標(biāo)是在太空建立空間實(shí)驗(yàn)室,讓科研人員長(zhǎng)期駐守在空間實(shí)驗(yàn)室內(nèi)進(jìn)行科研,這就對(duì)我國(guó)航天醫(yī)學(xué)的發(fā)展提出了更加嚴(yán)峻的要求。大量研究表明,當(dāng)航天員進(jìn)入空間失重環(huán)境后會(huì)出現(xiàn)失重性骨質(zhì)丟失,主要表現(xiàn)為骨量減少,骨礦度降低,糞鈣及尿鈣排出增多,血鈣升高,出現(xiàn)負(fù)鈣平衡,導(dǎo)致骨密度下降和骨質(zhì)疏松(osteoporosis),最終使骨力學(xué)性能下降,骨折風(fēng)險(xiǎn)增高。航天觀察與地面模擬實(shí)驗(yàn)

2、結(jié)果均顯示失重或模擬失重能導(dǎo)致人和動(dòng)物的持續(xù)骨質(zhì)丟失,研究表明太空飛行導(dǎo)致骨密度每個(gè)月約下降2%,相當(dāng)于一個(gè)婦女絕經(jīng)后1年的骨質(zhì)丟失量。這種骨質(zhì)丟失在航天飛行中呈進(jìn)行性改變,中長(zhǎng)期飛行會(huì)嚴(yán)重影響骨骼的結(jié)構(gòu)和功能。航天活動(dòng)中失重造成的骨礦鹽的持續(xù)丟失導(dǎo)致嚴(yán)重的骨質(zhì)疏松對(duì)宇航員的健康構(gòu)成了極大的威脅,成為人類(lèi)長(zhǎng)期停留太空和進(jìn)行星際探索的主要障礙之一。因此,對(duì)失重狀態(tài)下骨量減少的機(jī)理研究及如何預(yù)防失重骨質(zhì)丟失一直是航天醫(yī)學(xué)研究的重點(diǎn)和熱點(diǎn)。成

3、骨細(xì)胞是骨組織中最重要的力學(xué)感受細(xì)胞和成骨效應(yīng)細(xì)胞,目前大量研究已證實(shí),失重和模擬失重導(dǎo)致的骨質(zhì)丟失是一個(gè)以骨形成抑制起主導(dǎo)作用的過(guò)程,以成骨細(xì)胞數(shù)量下降、骨礦形成障礙和骨成熟延遲為特征。由于微重力下成骨細(xì)胞缺乏必要的機(jī)械應(yīng)力刺激,使其增殖和分化功能下降,導(dǎo)致成熟成骨細(xì)胞數(shù)量下降,骨形成減少,這是造成空間骨丟失的主要原因。而成骨細(xì)胞是由骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone mesenchymal stem cells,BMSCs)在體內(nèi)的各種調(diào)控

4、因素的調(diào)節(jié)下發(fā)展而來(lái)。骨形成包括BMSCs分化為成骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞成熟為骨細(xì)胞兩個(gè)過(guò)程。因此深入研究成骨細(xì)胞以及BMSCs在失重性骨質(zhì)丟失中的作用具有非常重要的意義。目前關(guān)于失重性骨質(zhì)丟失的研究焦點(diǎn)和熱點(diǎn)主要是成骨細(xì)胞對(duì)微重力的響應(yīng)、信號(hào)傳導(dǎo)、基因表達(dá)和功能變化及微重力對(duì)成骨細(xì)胞整個(gè)分化過(guò)程的影響。關(guān)于微重力對(duì)BMSCs超微結(jié)構(gòu)的影響報(bào)道甚少。 目的: 1.觀察在一定誘導(dǎo)條件下,體外分離培養(yǎng)的大鼠BMSCs向成骨細(xì)胞的定

5、向分化情況。熟悉并掌握細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù),為下一步實(shí)驗(yàn)奠定基礎(chǔ)。 2.探討模擬微重力對(duì)大鼠BMSCs成骨分化過(guò)程中堿性磷酸酶(ALP)活性及細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的影響。 方法: 1.大鼠BMSCs向成骨細(xì)胞的定向分化的驗(yàn)證:采用密度梯度離心與貼壁培養(yǎng)相結(jié)合的方法分離大鼠BMSCs,將分離純化的大鼠BMSCs傳代培養(yǎng)后隨機(jī)分成2組,實(shí)驗(yàn)組用含抗壞血酸、β-甘油磷酸鈉和地塞米松聯(lián)合誘導(dǎo)液的培養(yǎng)基培養(yǎng),對(duì)照組用未含誘導(dǎo)液的普通培養(yǎng)基

6、培養(yǎng)。 2.使用旋轉(zhuǎn)細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)(RCCS)中50ml容積的高截面縱橫比容器(High Aspect Ratio Vessel,HARV)模擬微重力,并結(jié)合Cytodex-3微載體進(jìn)行大鼠BMSCs成骨誘導(dǎo)培養(yǎng),觀察模擬微重力狀態(tài)下大鼠BMSCs定向成骨誘導(dǎo)后堿性磷酸酶(ALP)活性及細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的改變。 結(jié)果: 1、原代大鼠BMSCs接種后4d,可觀察到成纖維細(xì)胞樣的細(xì)胞集落,9至12d長(zhǎng)滿(mǎn)單層培養(yǎng)瓶底,傳代細(xì)

7、胞4至7d長(zhǎng)滿(mǎn)單層;大鼠BMSCs向成骨細(xì)胞定向誘導(dǎo)10天后,誘導(dǎo)組大鼠BMSCs ALP活性(13.016±2.423)明顯高于對(duì)照組ALP活性(0.675±0.103),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.002)。連續(xù)成骨誘導(dǎo)20 d后,可見(jiàn)多個(gè)散在分布的圓形不透明鈣化結(jié)節(jié),經(jīng)茜素紅染色后礦化結(jié)節(jié)呈紅色,而對(duì)照組細(xì)胞融合成片,未見(jiàn)礦化結(jié)節(jié)沉積。說(shuō)明在一定誘導(dǎo)條件下大鼠BMSCs能向成骨細(xì)胞定向分化。 2、RCCS中模擬微重力狀態(tài)下經(jīng)

8、成骨誘導(dǎo)液誘導(dǎo)10天后大鼠BMSCs ALP活性(0.724±0.089)明顯低于正常重力對(duì)照組ALP活性(13.167±2.550),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[P=0.002]。模擬微重力組透射電鏡下可見(jiàn)部分細(xì)胞出現(xiàn)凋亡的細(xì)胞學(xué)形態(tài)改變,部分細(xì)胞核呈不規(guī)則形,有1-2個(gè)核仁,胞質(zhì)內(nèi)含有豐富的細(xì)胞器,未見(jiàn)細(xì)胞膠原纖維以及鈣化基質(zhì)。對(duì)照組細(xì)胞胞漿豐富,粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基器發(fā)達(dá),核漿比例小,存在異染色質(zhì),明顯具有成熟細(xì)胞的表現(xiàn);細(xì)胞外基質(zhì)中出現(xiàn)排列

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