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文檔簡介
1、研究背景:正己烷作為一種有機(jī)溶劑,廣泛應(yīng)用于工業(yè)粘膠、印刷、電子微電子等行業(yè)。職業(yè)暴露過程中如果防護(hù)不當(dāng),正己烷將經(jīng)呼吸道、皮膚等途徑進(jìn)入機(jī)體導(dǎo)致中毒。長期接觸正己烷可導(dǎo)致以多發(fā)性周圍神經(jīng)病為主要臨床特征的慢性中毒,臨床上主要表現(xiàn)為四肢麻木、行走無力,肌肉萎縮等。2,5-己二酮(2,5-HD)是正己烷在體內(nèi)的最終代謝產(chǎn)物,也是正己烷誘發(fā)神經(jīng)毒性的終毒物。
2,5-HD神經(jīng)毒性作用的發(fā)生機(jī)制尚不明確。許多研究顯示,2,5-HD可
2、導(dǎo)致神經(jīng)元胞體和軸突損傷、神經(jīng)元數(shù)量減少。研究發(fā)現(xiàn),Bax、Bcl-2和Caspase-3參與多種因素誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞凋亡,Bax和Bcl-2是最重要的凋亡調(diào)控基因,Caspase-3是最關(guān)鍵的凋亡執(zhí)行蛋白酶。那么,2,5-HD誘導(dǎo)的神經(jīng)毒性是否與凋亡有關(guān),Bax、Bcl-2和Caspase-3是否參與了2,5-HD的神經(jīng)毒性機(jī)制?這些問題引起了我們的關(guān)注。
目的:探討2,5-HD誘導(dǎo)PC12細(xì)胞凋亡及相關(guān)機(jī)制,為闡明2,5-H
3、D的神經(jīng)毒作用機(jī)制提供依據(jù)。
方法:以PC12細(xì)胞作為神經(jīng)元的細(xì)胞模型,0、10mM、20mM和40mM2,5-HD分別染毒12h、24h、36h。用MTT比色法檢測細(xì)胞存活率;用蘇木素-伊紅(HE)染色法觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)的變化;Hoechst33342熒光染色觀察細(xì)胞核的變化;透射電子顯微鏡觀察細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的變化;用AnnexinⅤ-FITC/PI雙染流式細(xì)胞儀檢測PC12的細(xì)胞凋亡率;用Real-timePCR檢測Bax、B
4、cl-2和Caspase-3基因的表達(dá)情況;用Westernblot檢測Bax與Bcl-2的蛋白表達(dá)情況。
結(jié)果:MTT檢測結(jié)果顯示,隨2,5-HD濃度增加和染毒時(shí)間延長,細(xì)胞存活率下降。蘇木素-伊紅(HE)染色法觀察到2,5-HD染毒后PC12細(xì)胞形態(tài)發(fā)生明顯變化。Hoechst33342熒光染色觀察到特征性凋亡細(xì)胞核。透射電子顯微鏡觀察可見,40mM的2,5-HD作用36h后,核仁消失,染色質(zhì)聚集移動(dòng),有特征性凋亡小體形成
5、。AnnexinⅤ-FITC/PI雙染流式細(xì)胞儀檢測到細(xì)胞凋亡率隨2,5-HD劑量增高而上升,呈劑量反應(yīng)關(guān)系。RealTimePCR結(jié)果顯示隨2,5-HD劑量的增加和染毒時(shí)間延長,Bax和Caspase-3mRNA表達(dá)水平上調(diào),Bcl-2mRNA表達(dá)水平下調(diào)。Westernblot顯示,隨2,5-HD濃度增加和染毒時(shí)間延長,Bax蛋白表達(dá)水平上調(diào),Bcl-2蛋白表達(dá)水平下調(diào)。
結(jié)論:2,5-HD暴露可誘導(dǎo)PC12細(xì)胞凋亡,上調(diào)
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