2,5-己二酮生成吡咯加合物的離體研究.pdf

1、近年來，在我國有機溶劑誘發(fā)的職業(yè)中毒事件時有發(fā)生，正己烷(n-hexane)為飽和脂肪烴類，作為溶劑在工業(yè)中的使用日益廣泛，主要應(yīng)用于粘膠配制、除污、干洗、植物油提取、制鞋、印刷、油漆、制藥、家具制造及電子元件制造等行業(yè)。正己烷雖屬無毒類，但由于其高揮發(fā)性、高脂溶性，且有蓄積作用和神經(jīng)系統(tǒng)的毒性作用等特點，被認(rèn)為是高危害性毒物。正己烷的急、慢性中毒具體表現(xiàn)為不同的特征:急性正己烷中毒主要表現(xiàn)為急性腦病、皮膚及粘膜刺激癥;而慢性正己烷中毒

2、則以神經(jīng)毒性為主，主要表現(xiàn)為遠(yuǎn)端粗大神經(jīng)纖維軸突退行性病變導(dǎo)致的感覺-運動型周圍神經(jīng)病。在工業(yè)生產(chǎn)中，正己烷主要經(jīng)呼吸道、消化道、皮膚等途徑進(jìn)入人體，主要分布在腦、腎、肝、脾、睪丸等脂肪含量相對較高的組織。正己烷在體內(nèi)經(jīng)由肝臟的ω-1氧化作用代謝為2-己醇、2-己酮（甲基正丁基酮）、2，5-己二醇、5-羥基-2-己酮和2，5-己二酮(2，5-HD)，2，5-HD是正己烷和2-己酮的最終代謝產(chǎn)物和終毒物，是一種γ-二酮類化合物，與正己烷的

3、毒性有關(guān)，最終經(jīng)由腎臟排出。目前，國內(nèi)外均將尿中2，5-己二酮作為接觸正己烷生物監(jiān)測指標(biāo)，但由于酸化后尿中4，5-二羥基-2己酮和5-羥基-2-己酮向2，5-HD的轉(zhuǎn)化降低了該方法的準(zhǔn)確性與特異性。根據(jù)以前的研究顯示2，5-HD會與賴氨酸中的氨基反應(yīng)生成吡咯加合物，這也是正己烷中毒的機制之一，但有關(guān)吡咯加合物的文獻(xiàn)報道較少。大鼠與人的差異性導(dǎo)致實驗結(jié)果在外推時存在一定的誤差，以往的實驗均是基于大鼠體內(nèi)試驗或者是大鼠血清的體外孵育，關(guān)于血

4、清中的生物監(jiān)測指標(biāo)如何向人轉(zhuǎn)化沒有明確的系數(shù)。所以本實驗試用人和大鼠血清與2，5-HD體外共孵育，研究吡咯加合物的生成與血清中2，5-HD濃度的關(guān)系，確定人與大鼠血清在相同濃度2，5-HD下吡咯加合物生成的差異性，并且試探討抗氧化劑在阻止吡咯加合物生成后氧化中的作用，為正己烷中毒早期預(yù)防、臨床診斷及降低健康損害提供依據(jù)。
　　 方法
　　 1.混合正常人離體血清，過濾除菌后配制2，5-HD終濃度為200μg/ml，100

5、μg/ml，50μg/ml，25μg/ml，10μg/ml及空白血清，37℃孵育，不同時間點取血清，比色法測定血清中吡咯加合物的生成量，氣相色譜法測定血清中2，5-HD剩余量。
　　 2.混合正常人離體血清、正常大鼠混合血清，過濾除菌后配制2，5-HD終濃度為200μg/ml，50μg/ml，10μg/ml及空白血清，37℃孵育，不同時間點取血清，比色法測定血清中吡咯加合物的生成量，氣相色譜法測定血清中2，5-HD剩余量。

6、>　　 3.混合正常人離體血清，過濾除菌后配制空白組:2，5-HD終濃度為200μg/ml，50μg/ml，10μg/ml及空白組;抗氧化組:2，5-HD終濃度為200μg/ml，50μg/ml，10μg/ml及空白組，各組中保證維生素C的濃度為700mg/100ml。將兩組分別放入200μl的EP管中，封口膜密封，37℃孵育，不同時間點取血清，比色法測定血清中吡咯加合物的生成量，氣相色譜法測定血清中2，5-HD剩余量。
　　

7、 結(jié)果
　　 1.血清中吡咯加合物的含量隨孵育時間的延長而上升，且與2，5-HD存在劑量依賴性，實驗結(jié)束時吡咯加合物的含量在各濃度組間的差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05);血清中2，5-HD的含量隨孵育時間的延長而降低，實驗結(jié)束時按2，5-HD濃度由高到低，2，5-HD濃度分別下降29％、55％、22％、44％和40％;2，5-HD含量的減少量與吡咯加合物的增加量之間存在正相關(guān)關(guān)系，按2，5-HD濃度由高到低，相關(guān)系數(shù)R分別為0.

8、865、0.697、0.835、0.823和0.814。
　　 2.離體的人血清和大鼠血清與2，5-HD共孵育的過程中，吡咯加合物在人血清組與大鼠血清組內(nèi)差異存在統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），同一劑量組的不同血清之間也存在差異:各劑量組均從第1天起吡咯加合物含量在人血清中的含量就多于大鼠血清，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）;但隨時間的延長，這種差異逐漸減小:人血清中吡咯加合物的生成量與大鼠血清中吡咯加合物的生成量相比，在200μ

9、g/ml劑量組中，差異的倍數(shù)由實驗第1天時的2.88倍縮小至實驗結(jié)束時的1.11倍;50μg/ml劑量組中，差異的倍數(shù)由實驗第1天時的3.82倍縮小至實驗結(jié)束時的1.06倍;10μg/ml劑量組中，差異的倍數(shù)由實驗第1天時的3.98倍縮小至實驗結(jié)束時的1.28倍;相同2，5-己二酮劑量的不同血清之間2，5-HD剩余量差異不明顯。
　　 3.離體健康人群的混合血清與2，5-HD體外孵育過程中，抗氧化組與對照組相比，吡咯加合物的生成

10、量在200μg/ml組從第1天起抗氧化組明顯少于對照組，且一直延續(xù)到實驗結(jié)束，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)，甚至少于50μg/ml對照組（P＜0.05），與10μg/ml對照組對照接近。;50μg/ml組在前兩天出現(xiàn)吡咯加合物含量的交叉，但從第3天起，抗氧化組明顯少于對照組，一直延續(xù)到實驗結(jié)束，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）;10μg/ml組從第1天起吡咯加合物生成量抗氧化組明顯少于對照組，且一直延續(xù)到實驗結(jié)束，差異存在統(tǒng)計學(xué)意義

11、（P＜0.01）;空白對照組和維生素C對照組之間沒有統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05）。血清中2，5-HD含量測定表明剩余2，5-HD差異不明顯(P＞0.05)。
　　 結(jié)論
　　 1.隨2，5-HD濃度增加，吡咯加合物生成量增加;血清中2，5-HD減少量與吡咯加合物的增加量成正相關(guān)。
　　 2.人血清與大鼠血清在蛋白質(zhì)氨基酸組成上存在明顯的不同，具體體現(xiàn)在血清中吡咯加合物的生成量上:人血清中吡咯加合物的生成量多于大鼠血