蟲草素對魚藤酮誘導的PC12細胞凋亡的保護作用及其機制研究.pdf

1、目的:
　　探討蟲草素(Cordycepin，Cor)對魚藤酮(Rotenone，Rot)誘導的PC12細胞凋亡的保護作用及其作用機制。
　　方法:
　　應用不同濃度Rot作用于PC12細胞，選取最佳濃度1μmol/L建立PD體外細胞模型。觀察Cor本身對正常PC12細胞增殖的影響后，確定實驗分組:(1)對照組:0.01％ DMSO;(2)模型組:1μmol/L Rot;(3)Cor給藥組:0.4x10-6、2.0×1

2、0-6、8.0×106μmol/L Cor分別與1μmol/L Rot同時給藥。采用MTT法測定細胞存活率，比色法測定LDH釋放率，DNALadder檢測細胞凋亡，Hoechst33258核染色法和透射電鏡觀察不同時間細胞凋亡形態(tài)及其超微結構，以及流式細胞儀分析細胞凋亡比率，探討Cor對Rot誘導的PC12細胞凋亡是否具有保護作用。采用RT-qPCR法及Western blotting法測定細胞凋亡相關蛋白Bax、Bcl-2、Bcl-x

3、L、Caspase-3的mRNA和蛋白表達，研究Cor對PC12細胞凋亡的保護作用機制。
　　結果:
　　(1) Rot制備PD細胞模型:PC12細胞加入不同濃度Rot(0.1，0.25，0.5，0.75，1μmol/L)后在不同生長時間(24 h，48 h，72 h)其細胞OD值均呈明顯下降，差異有極顯著性意義(F=367.232，P＜0.001;F=2068.715，P＜0.001)。細胞的存活率亦呈下降趨勢，其作用隨R

4、ot的增加和作用時間的延長而增強。雙因素方差分析顯示藥物濃度與作用時間存在顯著交互作用(F=87.273，P＜0.001)，1μmol/L Rot72h時作用最強，細胞存活率降低至52.9％。后續(xù)實驗即以1μmol/L Rot進行造模。
　　(2) Cor對正常PC12細胞增殖的影響:將系列濃度Cor(10-6，10-5，10-4，10-3，10-2，10-1，1，10，102μmol/L)與正常PC12細胞孵育不同時間(24 h

5、，48 h，72 h)后，細胞OD值呈現升高或下降，在濃度水平和時間水平差異均具有顯著性(F=210.141，P＜0.001;F=549.775，P＜0.001);雙因素方差分析顯示濃度與時間存在顯著交互作用(F=26.553，P＜0.001):低濃度Cor(10-5～10-3μmol/L)在24h時能促進PC12細胞增殖(P＜0.05)，其余時間則無明顯影響(P＞0.05);而高濃度Cor(1～102μmol/L)在上述不同時間卻能夠

6、抑制PC12細胞增殖(P＜0.05，0.01，0.001)。本文后續(xù)實驗選用低濃度Cor進行。
　　(3) Cor對PD模型細胞存活率和LDH釋放率的影響:與對照組相比，1μmol/L Rot使PC12細胞存活率明顯下降(P＜0.001)，LDH釋放率顯著升高(P＜0.01)。模型細胞經0.4×10-6，2.0×10-6和8.0×10-6μmol/L Cor干預24 h，48 h和72h后，細胞存活率和LDH釋放率在時間水平上均具

7、有顯著性差異(F=201.495，P＜0.001;F=78.952，P＜0.001)，不同濃度組間差異也均具有顯著性(F=68.296，P＜0.001;F=65.281，P＜0.001)，且時間與濃度間都存在顯著交互作用(F=8.237，P＜0.001;F=7.054，P＜0.001)。與模型組相比，Cor干預組的細胞存活率顯著升高，LDH釋放率明顯下降，兩項指標均隨時間延長和濃度增加而增強(p＜0.05)。10-8～10-4μmol/

8、L Cor在24 h，48 h和72 h提高模型組細胞存活率的EC50分別為5.6×10-6，4.5×10-6和4.8×10-6μmol/L。結果表明Cor對Rot誘導的PC12細胞損傷具有一定的保護作用。
　　(4) DNA Ladder檢測:結果發(fā)現，經Rot處理48h的模型組細胞出現了大小約為180～200 bp及其整數倍的、典型的DNA“梯形”譜帶，而空白對照組和各劑量藥物組均未見明顯的DNA“梯形”譜帶，且各加樣孔中均殘

9、留有大片段的基因組DNA條帶。提示Cor干預48 h后，DNA片段化現象減少或消失。
　　(5) Hoechst33258核染色:結果發(fā)現，各時間段的對照組細胞核形態(tài)規(guī)則，核染色質均一、完好，細胞核為均一的藍色;而在Rot模型組，許多細胞出現核染色質固縮、凝聚、核碎裂等現象，細胞核出現致密的藍色亮點。0.4×10-6，2.0×10-6和8.0×10-6μmol/L Cor干預不同時間后均能改善上述形態(tài)變化，與模型組比較，細胞核出現

10、亮藍色的細胞減少，其中，8.0×106μmol/L Cor組變化最為明顯。
　　(6)細胞超微結構觀察:透射電鏡結果顯示，對照組細胞形態(tài)正常，表面微絨毛豐富，核及核膜結構清晰，常染色質豐富且分布均勻;胞質內細胞器明顯可見。模型組細胞則出現細胞核膜皺縮，染色質固縮、邊集，染色加深等典型的凋亡形態(tài)學特征，并形成凋亡小體。Cor干預后，PC12細胞的超微結構趨于正常，細胞的核膜清晰，核內染色質趨于正常，細胞質中可見完整的細胞器，細胞表面

11、出現少量的微絨毛，其中，8.0×10-6μmol/L Cor組細胞形狀呈圓形，絨毛較豐富，作用效果最為明顯。
　　(7)細胞凋亡率測定:流式細胞儀測定結果顯示，模型組早期凋亡及晚期凋亡細胞較空白對照組顯著增多(P＜0.001)，總凋亡率顯著上升(P＜0.001)。Cor干預后，晚期凋亡細胞明顯減少，總凋亡率顯著降低(P＜0.001)，其抑制作用隨劑量增加而增強，Cor三個濃度之間總凋亡率差異具有顯著性(P＜0.001)。
　

12、　(8) Bcl-2、Bcl-xL、Bax、 Caspase-3 mRNA表達量的測定:與對照組比較，模型組細胞內Bax mRNA的表達量明顯升高，Bcl-2和Bcl-xL mRNA的表達量呈明顯下降(P＜0.001)。Cor干預后，細胞Bax mRNA表達量較模型組明顯降低(P＜0.001);除0.4×10-6μmol/L Cor組外，其余組別Bcl-2、Bcl-xL mRNA表達量均顯著提高(P＜0.05，P＜0.01)，且8.0×

13、10-6μmol/L Cor作用差異最為明顯，表明Cor對PC12細胞Bcl-xL、Bax與Bcl-2mRNA表達量的影響具有顯著意義，且抑制或促進作用隨著劑量增加而明顯增強。與模型組相比，Caspase-3 mRNA表達量除對照組與其有顯著性差異(P＜0.01)外，Cor藥物組與之均未有明顯變化(P＞0.05)，提示Caspase-3在基因水平上未有顯著改變。
　　(9) Bcl-2、Bcl-xL、Bax、Caspase-3蛋白

14、表達量的測定:與對照組相比，模型組中Bax蛋白表達量顯著增加(p＜0.01)，而Bcl-2及Bcl-xL蛋白表達量明顯降低(p＜0.01，p＜0.01)。Cor的加入可以逆轉上述結果，且隨著Cor濃度的增加逆轉效果逐漸增強。對于調亡有直接影響的Bcl-2/Bax比值也隨著Cor濃度增大而呈上升趨勢。對Cleaved caspase-3蛋白水平的測定發(fā)現，與對照組相比，模型組Cleaved caspase-3的表達水平明顯升高(P＜0.0

15、01)，Cor的加入可以明顯逆轉上述作用(P＜0.001)，Cor濃度為8.0×10-6μm ol/L時作用差異最為顯著。結果提示，Cor對PD模型PC12細胞凋亡的保護作用可能是通過對Bax與Bcl-2、Bcl-xL蛋白表達的影響及抑制Caspase-3的活化而產生的。
　　結論:
　　Cor能抑制Rot誘導的PC12細胞凋亡，具有潛在的保護作用。其保護作用機制可能與下調Bax的表達、上調Bcl-2、Bcl-xL的表達以及