DON誘導(dǎo)PC12細(xì)胞凋亡線粒體信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制的研究.pdf

1、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（deoxynivalenol，DON）是世界范圍內(nèi)常見(jiàn)的一種真菌毒素，廣泛存在于農(nóng)作物及飼料產(chǎn)品中。研究發(fā)現(xiàn)，DON對(duì)人和畜禽具有神經(jīng)毒性、免疫毒性、生殖和發(fā)育毒性以及―三致毒性等。由于神經(jīng)系統(tǒng)的復(fù)雜性，人們對(duì)DON神經(jīng)毒性的認(rèn)識(shí)還不全面，目前仍處于探索階段。關(guān)于DON對(duì)神經(jīng)細(xì)胞毒性的體外研究鮮有報(bào)道，尤其在線粒體途徑引起的凋亡信號(hào)傳導(dǎo)機(jī)制方面。PC12細(xì)胞是一種優(yōu)越的神經(jīng)細(xì)胞模型，被普遍用在神經(jīng)機(jī)理方面的研究。因此

2、，本試驗(yàn)選擇PC12細(xì)胞作為研究對(duì)象，從線粒體途徑研究DON致使PC12細(xì)胞凋亡的具體機(jī)理。本試驗(yàn)首先以不同濃度DON（0、125、250、500、1000、2000 ng·mL-1）處理對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的PC12細(xì)胞24 h后，采用倒置顯微鏡及透射電鏡觀察PC12細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化，hoechst33258探查核酸的邊集情況，annexin V-FITC/PI染色測(cè)定凋亡率，流式細(xì)胞儀檢測(cè)線粒體膜電位，熒光定量PCR檢測(cè)凋亡相關(guān)基因的表達(dá)，we

3、stern-blot分析凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)，免疫熒光檢測(cè)Caspase3激活以及EMSA法檢測(cè)P53、AIF的轉(zhuǎn)錄活性。
　　結(jié)果顯示：
　　1.不同濃度DON處理PC12細(xì)胞24 h后，對(duì)照組細(xì)胞多為長(zhǎng)梭形，細(xì)胞間鏈接緊密；處理組細(xì)胞（圖2-1 B-F）稀疏，且DON濃度越大，細(xì)胞數(shù)量越少，細(xì)胞凸起消失，失去本來(lái)的伸展?fàn)顟B(tài)。電鏡下可見(jiàn)對(duì)照組細(xì)胞核正常、核仁清晰，染色質(zhì)分布均勻，線粒體結(jié)構(gòu)正常以及豐富的脊；而處理組細(xì)胞均出現(xiàn)

4、了核膜皺縮、染色質(zhì)聚集、線粒體腫脹、脊消失，部分線粒體空泡變性等明顯的細(xì)胞凋亡特征。Hoechst33258染色發(fā)現(xiàn)，對(duì)照組細(xì)胞核呈現(xiàn)均勻的藍(lán)光；而DON處理組呈現(xiàn)明亮的藍(lán)色，且隨著DON濃度的升高，出現(xiàn)的明亮藍(lán)色比例以及亮度均不同程度增加。
　　2.與對(duì)照組相比，處理組PC12細(xì)胞活性隨著DON濃度的升高而極顯著降低（P<0.01）；乳酸脫氫酶（LDH）的釋放量在DON濃度125~1000 ng·mL-1時(shí)略微增加，呈現(xiàn)出微弱的

5、量效關(guān)系；DON濃度達(dá)到2000 ng·mL-1時(shí)，LDH的釋放量極顯著增加（P<0.01）。
　　3.DON能誘導(dǎo)PC12細(xì)胞產(chǎn)生凋亡，各處理組凋亡率均極顯著升高（P<0.01），DON濃度在125~1000 ng·mL-1時(shí)，凋亡率呈濃度依賴性升高，而DON濃度為2000 ng·mL-1時(shí)，細(xì)胞凋亡率反而較1000 ng·mL-1有所降低。因此，本試驗(yàn)選擇1000 ng·mL-1DON濃度處理組，作為后續(xù)試驗(yàn)添加caspase

6、8抑制劑（FMK）的最佳濃度。
　　4.與對(duì)照組相比，處理組PC12細(xì)胞線粒體膜電位（MMP）隨著DON濃度的升高呈極顯著降低（P<0.01）。而與1000 ng·mL-1DON處理組相比，1000ng·mL-1 DON+caspase8抑制劑處理組MMP呈極顯著升高（P<0.01）。
　　5.與對(duì)照組相比，處理組PC12細(xì)胞Bax mRNA表達(dá)水平和Bax/Bcl-2比值均極顯著增加（P<0.01），且隨著DON濃度的增加

7、而升高，在1000 ng·mL-1時(shí)達(dá)到峰值；而B(niǎo)cl-2 mRNA表達(dá)水平隨著DON濃度的增加而降低，在濃度超過(guò)500 ng·mL-1時(shí)極顯著下降（P<0.01），在濃度為1000 ng·mL-1時(shí)達(dá)到最小值。Bid mRNA表達(dá)水平在DON濃度超過(guò)250 ng·mL-1時(shí)極顯著升高（P<0.01），并隨著DON濃度的增加而升高，在濃度為1000 ng·mL-1時(shí)達(dá)到峰值。與1000 ng·mL-1 DON處理組相比，1000 ng·

8、mL-1 DON+FMK處理組Bax和Bid mRNA表達(dá)水平以及Bax/Bcl-2比值均極顯著降低（P<0.01），而B(niǎo)cl-2 mRNA表達(dá)水平極顯著升高（P<0.01）。
　　6.與對(duì)照組相比，處理組PC12細(xì)胞cleaved-Caspase9蛋白表達(dá)量極顯著升高（P<0.01），并隨著DON濃度的增加而升高，在1000 ng·mL-1時(shí)達(dá)到最大值；cleaved-Caspase3蛋白表達(dá)量在濃度超過(guò)500 ng·mL-1時(shí)

9、極顯著增加（P<0.01），同樣也在DON濃度為1000 ng·mL-1時(shí)達(dá)到峰值；線粒體中AIF、Cyt C蛋白表達(dá)量隨著DON濃度的增加極顯著降低（P<0.01），在1000 ng·mL-1時(shí)達(dá)到最低。與1000 ng·mL-1DON處理組相比，1000 ng·mL-1 DON+FMK處理組cleaved-Caspase9和cleaved-Caspase3均極顯著降低（P<0.01），AIF蛋白表達(dá)量極顯著增加（P<0.01），而C

10、ytC蛋白表達(dá)量也有所增加，但差異不顯著。
　　7.采用激光共聚焦顯微鏡觀察Caspase3的激活情況，可見(jiàn)對(duì)照組細(xì)胞基本上無(wú)紅色熒光，而處理組細(xì)胞均出現(xiàn)不同程度的紅色熒光，且隨著DON濃度的升高而增強(qiáng)，在1000 ng·mL-1達(dá)到最高。另外，與1000 ng·mL-1DON處理組相比，1000 ng·mL-1 DON+FMK處理組紅色熒光明顯減弱。
　　8.與對(duì)照組相比，處理組PC12細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子AIF、P53的轉(zhuǎn)錄活性

11、均明顯增加，并隨著DON濃度的增加而升高。與1000 ng·mL-1DON處理組相比，1000 ng·mL-1 DON+FMK處理組細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子AIF、P53的轉(zhuǎn)錄活性明顯降低。
　　綜上所述，DON由于改變了細(xì)胞形態(tài)，損害了細(xì)胞膜和細(xì)胞核，從而引發(fā)PC12細(xì)胞凋亡。同時(shí)，DON降低了線粒體膜電位，導(dǎo)致Bax、Bid的上調(diào)及Bcl-2的下調(diào)。另外，DON促進(jìn)了Cyt C、AIF從線粒體釋放以及cleaved-Caspase3和cl