豬肺炎支原體P65蛋白的克隆表達(dá)、單克隆抗體制備及阻斷ELISA抗體檢測方法建立.pdf

1、豬肺炎支原體(Mycoplasmahyopneumoniae，Mhp)是引起豬支原體肺炎(Mycoplasmapneumoniaeofswine，MPS)的病原，給養(yǎng)豬業(yè)造成巨大的經(jīng)濟損失。由于缺乏對具有良好免疫原性的Mhp特異性蛋白的深入研究，使得Mhp在致病機制、血清學(xué)檢測方法和新型疫苗的研究發(fā)展上受到一定限制，從而影響了對MPS的控制。本試驗利用原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)了Mhp膜蛋白P65，并用該重組蛋白免疫小鼠，利用Mhp全菌蛋白和P6

2、5蛋白作為包被抗原進(jìn)行ELISA篩選，制備抗P65單抗，然后使用該重組蛋白作為包被抗原，酶標(biāo)單抗作為二抗，成功建立了單抗阻斷ELISA檢測方法。本研究主要從以下幾個方面展開:
　　1、根據(jù)GenBank公布的豬肺炎支原體(Mhp)P65基因序列，利用Primer5.0軟件設(shè)計合成引物，通過PCR擴增目的基因，將含有三個稀有密碼子的前922bp進(jìn)行基因合成，剩余910bp通過PCR擴增出來，然后采用SOE-PCR方法將前段基因片段和

3、后段基因片段連接起來，插入到表達(dá)載體pET-32a(+)中，構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pET-32a(+)/P65。將重組質(zhì)粒pET-32a(+)/P65導(dǎo)入大腸桿菌BL21(DE3)進(jìn)行表達(dá)，經(jīng)1％IPTG誘導(dǎo)表達(dá)3h后，蛋白的表達(dá)量最高，并用ProtinoNi-TED2000PackedColumns進(jìn)行親和純化，得到較純的目的蛋白。Western-blot分析表明表達(dá)蛋白具有良好的反應(yīng)原性。
　　2、本研究利用重組P65蛋白作為免疫原

4、，利用P65蛋白、Mhp168株F350代全菌蛋白、空載體蛋白篩選能分泌P65蛋白抗體的雜交瘤細(xì)胞株，經(jīng)過3次亞克隆，獲得了1株能穩(wěn)定分泌抗P65蛋白抗體的雜交瘤細(xì)胞株，命名為3G12。WesternBlot分析顯示，3G12能與Mhp168株F350代全菌蛋白及大腸桿菌表達(dá)的P65重組蛋白產(chǎn)生反應(yīng)，與空載體蛋白、豬鼻支原體（Mycoplasmahyorhinitis）蛋白不產(chǎn)生反應(yīng)。亞型鑒定顯示，該抗體的重鏈為IgG1，輕鏈為κ鏈。采

5、用間接ELISA測得3G12腹水與P65蛋白反應(yīng)的效價為1∶4000000，與168全菌蛋白反應(yīng)的效價為1∶25600，腹水經(jīng)商品化的ProteinG蛋白柱純化得到純度較高的單抗。
　　3、本研究將重組表達(dá)的蛋白P65作為包被抗原，把純化的單抗進(jìn)行HRP酶標(biāo)作為二抗，通過優(yōu)化其反應(yīng)條件成功建立阻斷ELISA方法。用酶標(biāo)儀讀取各孔OD450nm值，按照以下公式計算阻斷率:阻斷率(percentageinhibition/PI)=（陰

6、性血清OD450nm值-被檢血清OD450nm值）/陰性血清OD450nm值×100％。通過對已知血清的檢測，使用ROC標(biāo)準(zhǔn)曲線分析，當(dāng)OD450為0.563，敏感性和特異性的和最大，即為臨界值，此時阻斷率為36.456％。當(dāng)OD450＜0.563時，血清為陽性;當(dāng)OD450＞0.563時，血清為陰性。同時試驗證明，該方法與IDEXX試劑盒的符合率為92.92％，重復(fù)性較好，且與其他病原無交叉反應(yīng)?？捎糜贛hp流行病學(xué)調(diào)查和疾病診斷。<