自然殺傷細胞及其免疫調(diào)節(jié)機制對隱球菌感染影響及相關(guān)機制研究.pdf

1、第一部分自然殺傷細胞在隱球菌感染中的變化及其對隱球菌摩染病程的影響
　　 一、小鼠肺隱球菌感染模型以及NK細胞耗竭(NK cell depleted mice model)小鼠模型的建立
　　 目的：建立小鼠肺隱球菌感染模型以及NK細胞耗竭小鼠模型
　　 方法：C57BL/6小鼠經(jīng)腹腔注射2.5％Avertin麻醉后，于小鼠一側(cè)鼻孔內(nèi)緩慢滴入已調(diào)整濃度的菌液(接種量1×106/小鼠)。對照組小鼠經(jīng)小鼠一側(cè)鼻孔緩慢

2、滴入無菌PBS，觀察小鼠肺部病變、病理變化、臟器真菌載量。同時，C57BL/6小鼠予以腹腔注射anti-NK1.1單抗腹水(150μL/小鼠)，觀察小鼠脾細胞中NK細胞的變化。
　　 結(jié)果：經(jīng)鼻腔滴入隱球菌液后，小鼠肺部可見肉眼病灶，肺病理切片中可觀察到酵母菌，肺組織勻漿培養(yǎng)可見隱球菌菌落形成。小鼠經(jīng)anti-NK1.1單抗腹水處理后2天，脾細胞中NK細胞的比例明顯下降(>90％)，效果可持續(xù)10天以上。
　　 結(jié)論：通

3、過經(jīng)鼻滴入隱球菌液建立了小鼠肺隱球菌感染模型，經(jīng)腹腔注射anti-NK1.1單抗建立NK細胞耗竭小鼠模型。
　　 二、隱球菌感染時體內(nèi)自然殺傷細胞數(shù)量和功能變化的時相特征以及對于隱球菌感染病程的影響
　　 目的：系統(tǒng)探討隱球菌感染后感染灶局部和全身NK細胞數(shù)量和功能變化的時相特征，以及對于主要臟器的真菌載量和小鼠生存率的影響
　　 方法：使用小鼠肺隱球菌感染模型和NK細胞耗竭小鼠模型，將小鼠分為anti-NK1.

4、1未處理和處理組，觀察感染后第1、3、7、14天小鼠肺部及脾臟內(nèi)NK細胞數(shù)量、活化狀態(tài)、脫顆粒情況，觀察感染后第1、3、7、10、14天小鼠肺部和腦部真菌載量變化，觀察小鼠生存曲線的變化。
　　 結(jié)果：隱球菌感染后小鼠脾細胞總數(shù)、脾細胞中NK細胞數(shù)量、肺間質(zhì)白細胞總數(shù)、肺間質(zhì)白細胞中NK細胞數(shù)量均明顯增加，而小鼠體內(nèi)NK細胞耗竭對于脾細胞總數(shù)無明顯影響，但可顯著影響感染第7天時肺間質(zhì)白細胞總數(shù)(P<0.05)。小鼠隱球菌感染后，

5、NK細胞表面CD69表達、CD107a的表達、胞內(nèi)IFNγ的分泌、胞內(nèi)perforin的表達在感染早期即明顯增加，以感染后第3天時最為明顯，隨后即逐漸下降。Anti-NK1.1未處理組小鼠隱球菌感染后肺部真菌載量在感染早期逐漸增加，感染后10天至14天最為明顯，其后有逐漸下降趨勢，而anti-NK1.1處理小鼠則隨感染時間延長而逐漸增加，兩組小鼠在感染第3天、第14天、第28天有顯著差異(P<0.05)。隱球菌感染小鼠在感染后7天左右腦

6、部勻漿真菌培養(yǎng)陽性，但兩組小鼠間無顯著差異(P>0.05)。與anti-NK1.1未處理組小鼠相比，anti-NK1.1處理組的小鼠死亡出現(xiàn)更早且死亡比例更高，兩組間差異具有統(tǒng)計學意義(P=0.0007)。
　　 結(jié)論：隱球菌感染時，感染小鼠肺部和全身NK細胞數(shù)量明顯增加，NK細胞耗竭可影響肺部間質(zhì)白細胞總數(shù)。小鼠肺部隱球菌感染后，小鼠NK細胞均可被活化，NK細胞脫顆粒能力增強，且在感染后第3天時最為明顯。小鼠體內(nèi)NK細胞耗竭后

7、可顯著增加感染早期和后期肺部真菌載量，但對腦部真菌載量無影響。體內(nèi)NK細胞耗竭后可顯著影響隱球菌感染小鼠的生存曲線。
　　 一、自然殺傷細胞在隱球菌感染時對適應(yīng)性免疫的影響
　　 目的：研究小鼠隱球菌感染時NK細胞對機體適應(yīng)性免疫反應(yīng)的影響。
　　 方法：使用小鼠肺隱球菌感染模型和NK細胞耗竭小鼠模型，將小鼠分為anti-NK1.1未處理和處理組，檢測小鼠感染后第7天、第14天時肺間質(zhì)白細胞中CD4+T細胞內(nèi)IF

8、Nγ、IL-4分泌情況，測定小鼠感染后第7天、第14天時肺組織勻漿中IFNy、IL-4的水平。
　　 結(jié)果：小鼠肺隱球菌感染后第7天和第14天，肺間質(zhì)白細胞中CD4+T細胞胞內(nèi)IFNv分泌均顯著增加(P<0.05)，呈逐漸上升趨勢。而肺間質(zhì)白細胞中CD4+T細胞胞內(nèi)IL-4分泌于感染后第7天最顯著，至感染后第14天則較第7天有所下降。當體內(nèi)NK細胞耗竭后，小鼠肺間質(zhì)白細胞中CD4+T胞IFNγ分泌較未處理小鼠顯著減少，而且在感染

9、第14天時較感染后第7天時無明顯增加，小鼠肺間質(zhì)白細胞中CD4+T細胞IL-4分泌則逐漸增加。小鼠肺隱球菌感染后第7天和第14天，肺組織勻漿中IFNv水平均顯著增加，呈逐漸上升趨勢，而NK細胞體內(nèi)耗竭后，增加程度顯著下降(P<0.05)。小鼠肺隱球菌感染后第7天和第14天，肺組織勻漿中IL-4水平均顯著增加(P<0.05)，以感染后第7天最為明顯(P<0.05)，感染后第14天較感染后第7天顯著下降(P<0.05)。當體內(nèi)NK細胞耗竭后

10、，肺組織勻漿中IL-4水平顯著增加，且感染后第14天較感染后第7天升高。
　　 結(jié)論：隱球菌感染后，機體誘導形成的Th1免疫反應(yīng)逐漸增強，Th2免疫反應(yīng)在感染后第7天則逐漸減弱。當體內(nèi)NK細胞耗竭后，機體誘導形成的Th1免疫反應(yīng)雖逐漸增強，但程度明顯減弱，而Th2免疫反應(yīng)則明顯增強，從而影響機體的Th1/Th2平衡。
　　 二、自然殺傷細胞在隱球菌感染時對樹突狀細胞的影響
　　 目的：研究隱球菌感染時DC的成熟狀

11、態(tài)和功能，探討NK細胞對于上述變化的影響。
　　 方法：利用小鼠骨髓細胞誘導的DC(BMDC)與熱滅活隱球菌共孵育，觀察BMDC的共刺激因子表達，檢測培養(yǎng)上清中IL-12p40和TNFα水平。使用小鼠肺隱球菌感染模型和NK細胞耗竭小鼠模型，將小鼠分為anti-NK1.1未處理和處理組，體內(nèi)觀察感染第7天時DC的表面共刺激因子的表達，檢測肺間質(zhì)白細胞中DC比例、數(shù)量、類型的變化，觀察，細胞的變化，測定肺組織勻漿中IL-12p40的

12、水平，以及NK細胞體內(nèi)耗竭對上述變化的影響。
　　 結(jié)果：BMDC與熱滅活隱球菌共孵育后，BMDC表面MHCⅡ、CD80、CD86表達均顯著增加，其培養(yǎng)上清也中IL-12p40和TNFα水平也顯著升高(P<0.05)。小鼠感染后第7天時，DC表面MHCⅡ、CD80、CD86表達均增加，以MHCⅡ最為顯著，當體內(nèi)NK細胞耗竭后，MHCⅡ和CD86表達但較未處理的感染小鼠顯著下降，而CD80感染后表達無明顯增加。小鼠感染后第7天時，

13、肺間質(zhì)白細胞中DC的比例和絕對數(shù)量、CD45+CD11b+Gr-lint細胞的比例均明顯增加(P<0.05)，當體內(nèi)NK細胞耗竭后，雖然DC比例和絕對數(shù)量以及CD45+CD11b+Gr-lint細胞仍高于未感染小鼠，但顯著低于未處理小鼠(P<0.05)。小鼠隱球菌感染后，肺間質(zhì)白細胞中DC的類型均以mDC為主，兩組間無明顯差異(P>0.05)。小鼠肺隱球菌感染后第7天，肺組織勻漿中IL-12p40水平顯著上升，但體內(nèi)NK細胞耗竭時IL-

14、12p40水平可顯著降低(P<0.05)。
　　 結(jié)論：隱球菌感染后增加感染灶中DC的比例和數(shù)量，誘導DC的成熟，增加細胞因子分泌，促進機體Th1免疫反應(yīng)形成。隱球菌感染后感染灶中DC以mDC為主。隱球菌感染時，感染灶中DC前體細胞增加，可使感染灶中DC數(shù)量增加。體內(nèi)NK細胞耗竭后，DC感染灶中DC前體細胞比例、DC的比例和數(shù)量、DC的成熟狀態(tài)機細胞因子的分泌均受到影響，由此可能影響Th1免疫反應(yīng)的形成，但DC的類型無明顯改變。