幼年感染內(nèi)毒素對大鼠成年后EAE發(fā)病的影響及相關免疫調(diào)節(jié)機制.pdf

1、目的:觀察幼年感染內(nèi)毒素對Sprague Dawley(SD)大鼠成年后實驗性自身免疫性腦脊髓炎(experimental autoimmune encephalomyelitis，EAE)神經(jīng)功能損傷和中樞病理改變的影響，并通過觀察這些大鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)(centralnervous system，CNS)內(nèi)小膠質(zhì)細胞、星形膠質(zhì)細胞的變化以及細胞因子的改變，探討幼年感染細菌內(nèi)毒素影響大鼠成年后EAE發(fā)病可能的免疫調(diào)節(jié)機制。
　　方

2、法:選取出生時10～12只每窩的SD幼鼠4窩（共44只）作為實驗對象，每窩SD幼鼠隨機分為兩組，分別為LPS處理組（共24只）和生理鹽水對照組（共20只），出生后第3天和第5天兩次分別給予幼鼠腹腔注射0.01mg/ml細菌脂多糖(Lipopolysaccharide，LPS)0.05ml或同等劑量無菌生理鹽水，成年后（出生后第8周）再給予這些大鼠四肢足墊皮下注射0.4ml的豚鼠脊髓勻漿(guineapig spinal cord hom

3、ogenate，GPSCH)和完全弗氏佐劑(completeFreund's adjuvant，CFA)混合制成的抗原乳劑免疫誘導EAE，免疫當日定為第0天，并于免疫后0h及48h分別在大鼠兩側(cè)腹股溝皮下注射0.1ml(1×109菌體)百同咳菌苗。免疫后每天早晚2次定點稱量大鼠體重、觀察其行為學變化并做詳細記錄，比較兩組大鼠EAE發(fā)病的潛伏期、發(fā)病率和神經(jīng)癥狀評分。免疫后第21天處死大鼠（相當于臨床發(fā)病高峰期），選取兩組各半數(shù)大鼠的腦和

4、脊髓組織進行HE染色和luxol fast blue髓鞘染色，光鏡下觀察組織的病理改變;并采用免疫組織化學法檢測CNS內(nèi)各部位小膠質(zhì)細胞和星形膠質(zhì)細胞的變化，分別以離子鈣結(jié)合受體分子1(ionized calcium-binding adaptor molecule1，Iba-1)抗體和膠質(zhì)纖維酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein，GFAP)抗體標記，并進行定量分析。同時用酶聯(lián)免疫吸附試驗(enzym

5、e linkedimmunosorbent assay，ELISA)法檢測剩余兩組各半數(shù)大鼠CNS內(nèi)各部位白介素-17(interleukin-17，IL-17)、干擾素-γ(interferonγ，IFN-γ)和白介素-10(interleukin-10，IL-10)的蛋白表達水平。
　　結(jié)果:
　　(1)行為學觀察:生理鹽水對照組SD大鼠最早于免疫后第12天出現(xiàn)癥狀，LPS處理組大鼠亦于免疫后第14天開始發(fā)病，發(fā)病大鼠表

6、現(xiàn)為活動減少、體重下降，先后出現(xiàn)尾肌力降低、尾巴拖地不能抬起、后肢無力、步態(tài)異常、四肢癱瘓甚至瀕死狀態(tài)等典型的EAE癥狀。LPS處理組大鼠EAE發(fā)病率7/24，與生理鹽水組(18/20)相比明顯降低（P＜0.01）。從病情嚴重度來看，免疫后LPS處理組大鼠EAE癥狀評分比生理鹽水組低，組間差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），LPS處理組大鼠EAE最大癥狀評分0.65±0.24，與生理鹽水組(2.25±0.27)相比明顯下降(P＜0.01)

7、。但兩組大鼠發(fā)病潛伏期相比無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。
　　(2)組織病理學改變:HE染色見發(fā)病大鼠的腦、脊髓實質(zhì)內(nèi)有大量炎性細胞浸潤，以淋巴細胞為主，分布以小腦、腦干、頸髓和腰髓居多，大多在白質(zhì)和灰白質(zhì)交界區(qū)，有些炎癥細胞圍繞在小血管周圍，形成典型的“血管袖套樣”改變。luxol fast blue髓鞘染色見發(fā)病大鼠腦和脊髓白質(zhì)內(nèi)有大小不等的片狀髓鞘脫失，也是以小腦、腦干、頸髓和腰髓為著。LPS處理組與生理鹽水組相比CNS內(nèi)炎

8、癥細胞浸潤和髓鞘脫失等病理改變明顯減輕，大腦、小腦、腦干、頸髓（頸膨大）、胸髓和腰髓（腰膨大）的炎癥病理評分降低，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。
　　(3)小膠質(zhì)細胞Iba-1和星形膠質(zhì)細胞GFAP免疫組化結(jié)果:生理鹽水組大鼠CNS內(nèi)尤其是小腦、腦干和脊髓內(nèi)小膠質(zhì)細胞和星形膠質(zhì)細胞增生活化明顯，表現(xiàn)為Iba-1和GFAP染色明顯加深，陽性細胞數(shù)目增多，Iba-1陽性細胞突起回縮變濃，胞體變大;GFAP陽性細胞細胞突起變粗變長，

9、胞體增大。與生理鹽水對照組相比，LPS處理組大鼠大腦、小腦、腦干、頸髓、胸髓和腰髓Iba-1陽性細胞和GFAP陽性細胞數(shù)目均明顯減少，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。
　　(4)細胞因子ELISA檢測結(jié)果:LPS處理組大鼠大腦、小腦、腦干、頸髓和腰髓內(nèi)促炎細胞因子IL-17和IFN-γ表達水平較生理鹽水組相比均明顯降低，而抗炎細胞因子IL-10表達水平明顯升高，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。
　　結(jié)論:
　　(

10、1)本實驗采用GPSCH-CFA免疫誘導SD大鼠制作的EAE模型是成功的。
　　(2)幼年時期給予LPS處理能夠降低SD大鼠成年后EAE的發(fā)病率，減輕神經(jīng)系統(tǒng)癥狀，減少中樞炎癥細胞浸潤和髓鞘脫失等病理改變，提示幼年感染細菌內(nèi)毒素對大鼠成年后EAE有神經(jīng)保護作用。
　　(3)幼年時期給予LPS處理可能通過抑制大鼠成年后在GPSCH誘導下小膠質(zhì)細胞和星形膠質(zhì)細胞的增生活化，從而發(fā)揮對成年大鼠EAE的神經(jīng)保護作用。
　　(4